[发明专利]用于检测C‑KIT基因1654‑1689位突变的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测C-KIT基因突变的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

C-KIT是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，全长约80kb。C-KIT编码的C-KIT蛋白属于III型受体酪氨酸激酶家族成员，它是分子量约为145KD的跨膜蛋白，包含了胞内的酪氨酸激酶区、跨膜区和配体结合位点胞外区。当配体与其结合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节细胞的生长与增殖。

胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突变率约为90％。

目前Sanger测序法是C-KIT基因突变检测的主要方法。然而，该方法的灵敏度低，会导致漏检及假阴性的发生，而且检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。临床上迫切需要开发一种高灵敏度、快速的C-KIT基因突变检测技术。

本发明的发明人在胃肠道间质瘤(GIST)的日常检测中发现了与胃肠道间质瘤有关的位于C-KIT基因的新突变位点，即1654-1689位缺失突变。本发明的发明人针对该突变开发了一种快速、高灵敏、操作简便的检测试剂盒及相关的检测方法，可以用于GIST化疗预后。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测C-KIT基因突变的引物和探针，所述突变是1654-1689位缺失36碱基突变(碱基突变：1654_1689del36，蛋白突变：M552_I563del)。本发明的引物与探针包括如下序列：

正向引物(F)：CCCACAGAAACCCAATGGAA(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：AAGTCACTGTTATGTGTACCCAA(SEQ ID No：2)

探针(PB)：CATGGAAAGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID No：3)

本发明另一方面提供一种用于检测C-KIT基因1654-1689位突变的检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探针。

根据所采用的PCR方法，本发明的试剂盒还可以包括内参基因和内控基因。

本发明另一方面提供一种检测C-KIT基因1654-1689位突变的方法，其包括以下步骤：

(1)提取样本中的基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血和血浆等；

(2)用本发明的试剂盒对DNA进行扩增；

(3)根据荧光PCR仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴性、阳性判定标准，Ct值＞38或无扩增为阴性，Ct值≤38为阳性。

本发明采用了特异性引物和探针技术，可以特异性检测C-KIT基因突变。此方法灵敏度高、特异性强、检测速度快。

附图说明

图1为检测阴性样本(野生型)的PCR图。

图2为检测突变阳性样本的PCR图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

一.原理

本发明的特异性引物与探针同DNA模板结合后，Taq DNA聚合酶以脱氧核苷酸(dNTP)为底物，对内参基因(Internal Reference，IR)及C-KIT基因突变型基因进行体外扩增。检测采用荧光PCR技术，通过特异性探针水解释放荧光，监测PCR反应的进行，确定C-KIT基因突变情况。

本发明的试剂盒单独设置了内参基因检测体系。内参基因是区别于待检C-KIT基因的管家基因。通过检测内参基因的扩增情况(FAM通道)，可分析待检DNA是否能被正常扩增，从而排除DNA纯度、浓度不佳，或者含有PCR抑制剂等造成PCR检测失败的情况。