[发明专利]一种(D)‑2‑羟基戊二酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于(D)-2-羟基戊二酸临床样本检测技术领域，具体涉及一种检测体外血清中(D)-2-羟基戊二酸浓度的试剂盒。

背景技术

(D)-2-羟基戊二酸(D-2-Hydroxyglutarate，D2HG)是一种五个碳原子的二羧基酸，在正常人细胞和组织中的含量很低，但是在某些代谢疾病和癌症患者中的含量显著上升。近年来的研究发现，继发性胶质母细胞瘤，软骨肉瘤，胆管细胞癌和急性髓细胞白血病(AML)等癌症患者中发现异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase 1/2，IDH1/2)突变，IDH1/2突变后将α-酮戊二酸(α-KG)催化为D2HG，从而导致细胞中D2HG的含量显著上升，D2HG通过竞争性抑制依赖于α-KG的双加氧酶活性来促进癌细胞转化。D2HG是IDH突变后导致其含量显著性增加的原癌代谢物，血清中D2HG含量是IDH突变的替代检测指标，高含量的D2HG为不良预后因子，而且D2HG含量可以作为AML患者微小残留疾变(MRD)的标志物。

目前，国内外检测D-2-羟基戊二酸浓度的方法主要还是通过液相层析-质谱分析法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)或者气相层析-质谱分析法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)，但这两种方法都是操作过程复杂、周期较长，仪器设备昂贵且对操作人员要求较高，不适合高通量的临床样本检测。因此，开发一种快速、简便地检测D2HG的试剂盒是非常有必要的。

发明内容

本发明基于酶反应比色法建立的D2HG浓度检测方法，提供一种简便、快速的检测试剂盒，具有特异性强、精确度高和高通量检验等优点。能够弥补现有检测技术的不足，满足血清中D2HG浓度检测需要，具有重要的临床意义和应用价值。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：一种(D)-2-羟基戊二酸检测试剂盒，由以下组分组成：

A、样本处理液A：百分比为8％的高氯酸溶液。

B、样本处理液B：5.5M氢氧化钾溶液。

C、反应缓冲液：1M的Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0。

D、反应底物1：10mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。

E、反应底物2：3mM四唑盐(MTS)。

F、反应底物3：825μM N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)。

G、酶：45μg(D)-2-羟基戊二酸脱氢酶。

H、标准品溶液：10mM(D)-2-羟基戊二酸钠盐。

I、96孔微孔板一块和封板膜一张。

以上所述的酶浓度为0.3μg/μL，体积为150μL。

所述的试剂盒对D2HG的最佳检测浓度范围为5μM-120μM。

在对D2HG进行测定的过程中，反应体系在均一的液相中进行，无需分离步骤。

本发明的原理是利用D2HG脱氢酶特异性地催化D2HG反应，根据反应生成底物的吸光值检测D2HG浓度。

本发明提供的D2HG检测试剂盒可应用于血清中D2HG浓度的定量分析，具有简便快速、特异性强、成本低、准确的特点，在临床应用方面具有显著优势。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为D2HG检测试剂盒标准曲线。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙等译校。北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1D2HG检测试剂盒组分及制备过程

A、样本处理液A：11.26mL百分比为71％的高氯酸加去离子水定容至100mL制成。

B、样本处理液B：30.8g氢氧化钾溶于100mL去离子水制成。

C、反应缓冲液：1mol/L的Tris-HCl缓冲液，用饱和HCl溶液调pH为8.0。

D、反应底物1：称量331.7mg的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)粉末，溶解于5mL去离子水中，再稀释10倍即为10mmol/L的NAD溶液。

E、反应底物2：避光称量14.63mg的四唑盐(MTS)粉末，溶解于1mL DPBS缓冲溶液中，再稀释10倍即为3mmol/L的MTS溶液。