[发明专利]特异捕获并重复复制低频率DNA碱基变异的方法及应用

权利要求书

1.一种特异捕获并重复复制低频率DNA碱基变异的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括以下步骤：

（1）对DNA进行热变性，然后用具有热力学动态结构的引物混合物对目标DNA进行杂交，用DNA聚合酶以目标DNA为模板进行延伸复制，重复上述变性和杂交过程，完成对模板的重复复制；

（2）利用与测定目标 3端匹配的寡聚核苷酸对重复复制出的次生DNA片段进行特异性延伸、加尾，并在其次生产物的3端引入一段共同序列；

（3）用含有测序条码的引物进行PCR扩增，完成测序文库的构建；

（4）对测序文库进行高通量平行测序以生成多个测序读值；

（5）鉴定测序读值与参考序列之间的序列差异；

（6）将从所述的核酸样品获得的多个读值中以0 .01％或更高的频率发生的序列差异判定为序列变体；

其中，步骤（1）中所述的具有热力学动态结构的引物是探针长度为12nt-16nt的欧米伽引物，或者是探针长度为12nt-16nt的茎环引物，或者是探针长度为12nt-16nt的欧米伽引物与探针长度为12nt-16nt的茎环引物的组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的具有热力学动态结构的引物5端含有特定的序列组合，为高通量平行测序所需锚定序列、样本条码序列或测序引物靶点序列中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶，或高保真DNA聚合酶与高效率聚合酶的组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述杂交温度为4℃到35℃的范围，并与50℃以上的温度交替进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述重复复制是在低温下完成引物与DNA的杂交和延伸，然后在高温进行热变性的过程；或在两个或两个以上低温度进行多次循环后进行高温热变性，所述重复复制是一次或一次以上的重复。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的具有热力学动态结构的引物对特定目标片段的覆盖是两个或两个以上，以串联的方式完成。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的具有热力学动态结构的引物对特定双链目标片段的覆盖是针对其中一条链，或者是针对其互补链，又或者是同时针对二者。

8.权利要求1-7任意一项所述的方法的应用，其特征在于：制备用于非诊断目的的检测低频率DNA碱基变异的测定试剂或试剂盒套装。