[发明专利]一种焦磷酸测序检测clade2.1.3分支H5N1亚型禽流感病毒的方法

说明书

本发明公开了一种焦磷酸测序检测clade2.1.3分支H5N1亚型禽流感病毒的方法。本发明提供了一种检测clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的成套引物，包括如下引物对：所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。上述成套引物还包括核苷酸序列为序列表中序列3的测序引物。本方法的特异性强、灵敏度高，与病毒分离和血凝抑制实验等常规实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％，可以及时对禽染病情况及区域、环境的病毒污染情况作出及时快捷的检测和确诊，这对于及时监测clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒入境传播具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种焦磷酸测序检测clade2.1.3分支H5N1亚型禽流感病毒的方法。

背景技术

传统的禽流感病毒检测方法为接种鸡胚进行病毒分离培养(需时2-3天)，然后采用血凝抑制试验进行流感病毒亚型的鉴定(需时1天)。传统的检测方法具有费时、费力的弊端，难以做出快速而及时的诊断，且传统的检测方法对同源性较高的病毒不能做出准确的区分。

高致病H5N1亚型禽流感病毒已在亚洲、欧洲、非洲15个国家的家禽中流行，并引发人的感染。在这些国家中，印尼的发病数及死亡率居全世界首位。截止2015年9月，印尼已有199人确诊感染H5N1禽流感病毒，167人死亡，发病数及死亡率居全世界首位。印尼地区主要流行的H5N1毒株为clade 2.1分支，包括2.1.1，2.1.2，2.1.3。自2005年以来，calde 2.1.1和clade2.1.2所占比例明显减少，而clade 2.1.3逐渐成为印尼主要流行毒株，且几乎所有感染人的毒株均属于clade 2.1.3分支。表明clade2.1.3分支病毒相比于其他分支H5亚型流感病毒对人类的感染性、致病性更强。目前为止，我国尚未有人或禽类感染clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的报道，但是禽产品贸易交流以及候鸟迁徙都可能将clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒传入我国。因此，建立一种快速有效的诊断该分支病毒的方法，对于监测clade2.1.3分支H5N1禽流感病毒入境传播具有重要意义。

对于传统的检测方法，如病毒分离、血凝抑制试验、神经氨酸酶试验等，费时、费力，不能做出快速而及时的诊断。对于相关分子生物学检测方法，如单一RT-PCR方法及多重RT-PCR方法，无法仅仅通过PCR电泳结果对同源性较高的病毒做出准确的区分，还需要进行Sanger测序，并进行基因进化分析。因此，建立一种针对clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的新型检测方法非常重要。

焦磷酸测序技术作为近年来发明的一种新型序列分析技术，它通过核苷酸与模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测，能够针对已知的短序列，在很短的时间内对目的序列进行基因序列分析，具有快速、准确、实时等优点，其重复性和精确性能够与sanger DNA测序法相媲美。另外，Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的所读序列较长。在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十对碱基就可以满足需要。在这种情况下，Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测clade 2.1.3分支H5N1禽流感病毒的成套引物，包括如下引物对：

所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。

上述成套引物中，所述引物对中的一条引物末端生物素标记。

上述成套引物还包括核苷酸序列为序列表中序列3的测序引物。

含有上述成套引物的成套PCR试剂或含有所述成套引物或所述成套PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

上述成套PCR试剂中，所述成套PCR试剂由PCR试剂1和PCR试剂2组成；