[发明专利]一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种用于牛鼻支原体分离纯化的液体培养基，其特征在于，每1000ml液体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、1%酚红2.5 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml、余量为去离子水；

所述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用盐酸溶液调pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液，将上清液用1 M NaOH调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000ml，即得到25%新鲜酵母浸出液，-20℃保存备用；所述盐酸溶液中，按照体积比浓盐酸：水为1：1。

2.一种用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基，其特征在于，所述用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基中，每1000ml固体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml、琼脂粉15.0g、余量为去离子水；

所述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用盐酸溶液调pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液，将上清液用1 M NaOH调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000ml，即得到25%新鲜酵母浸出液，-20℃保存备用；所述盐酸溶液中，按照体积比浓盐酸：水为1：1。

3.一种权利要求1所述的用于牛鼻支原体分离纯化的液体培养基的制备方法，其特征在于，每1000ml液体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，再加入1%酚红2.5 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g，量取60 ml 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，再加入滤过除菌100 mg/ml氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1 M NaOH调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，得到液体培养基，置4℃保存备用。

4.一种权利要求2所述的用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基的制备方法，其特征在于，每1000ml固体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g、琼脂粉15.0 g，量取60 ml/L 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，再加入滤过除菌100 mg/ml的氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1M NaOH调pH值到7.2-7.4，摇匀，倒平皿，得到固体培养基，置4℃保存备用。