[发明专利]链霉菌重组质粒pIJ8600‑attM及其构建方法和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种链霉菌重组质粒pIJ8600-attM及其构建方法和其应用。

背景技术

群体感应(quorum sensing,QS)机制被微生物用于调控一些具有社会性的生物学行为，使单细胞的细菌、放线菌体现出多细胞生物的特征，如细菌群游、生物发光、生物膜形成、毒素/抗生素合成、致病性产生、与宿主共生等。QS在细菌、放线菌与真核生物宿主的相互关系(共生、内生或者致病)以及微生物次生代谢调控方面起着举足轻重的作用。故在致病菌防治、生物膜清除、毒素抑制等领域有着广泛应用。QS运行有赖于微生物细胞密度达一定阈值后QS信号分子产生，从而激活相关基因转录与表达。在革兰氏阴性细菌中QS信号分子是N-酰基高丝氨酸内酯类,革兰氏阳性细菌中QS信号分子为寡肽类，而在放线菌如链霉菌中,QS信号分子的化学本质是γ-丁内酯。

自然界中同时存在群感淬灭(quorum quench,QQ)现象，主要通过竞争性抑制QS受体蛋白或者降解QS信号分子而发挥作用。目前群感淬灭酶(QQ酶)研究对细菌QS涉及较多，而鲜见针对链霉菌QS的研究。attM基因首先在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58菌株中发现，其表达产物为解酯酶AttM，详见文献：“Carlier A，Chevrot R,Dessaux Y,and Faure D.The assimilation ofγ-butyrolactone in Agrobacterium tumefaciens C58interferes with the accumulation of the N-acyl-homoserine lactone signal.Mol.Plant-Microbe Interact.2004,17(9):951–957.”。AttM具有以下活性：分解γ-丁内酯生成γ-羟基丁酸，后者再被降解为其他产物而进入三羧酸循环，详见文献：“Uroz S,Dessaux Y,Oger P.Quorum sensing and quorum quenching:The Yin and Yang of bacterial communication.ChemBioChem.2009,10(205):205–216.”；因此，解酯酶AttM可用于靶向干扰链霉菌的致病性，在链霉菌所致的动植物病害防治方面有广泛应用前景。

迄今，在遏制链霉菌所致的动植物病害比如马铃薯疮痂病、以及抑制潮湿建筑物室内空气中灰黄链霉菌产生的缬氨霉素等次生代谢物方面，国内外提出了利用化学、物理、生物学方法等多种解决途径。其中生物学方法具有无毒、无残留的优势，并且基于QQ的生物防治方法具有不影响致病性链霉菌初生代谢的特点，故而避免耐药性菌株出现。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种链霉菌重组质粒pIJ8600-attM及其构建方法和其应用，该重组质粒用于链霉菌QS信号分子γ-丁内酯降解，可应用于基于QQ的动植物放线菌病原体的防治、同时用于空气、水体等环境中某些放线菌所产次生代谢物的抑制。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种重组质粒，所述质粒是基于大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pIJ8600，采用限制性酶切以及DNA连接原理，插入了功能性的解酯酶基因attM片段构建而成；它包含来源于pUC18质粒的DNA复制起点(ori)、便于在大肠杆菌与链霉菌中筛选的阿泊拉霉素(Apra)抗性标记aac(3)IV、便于接合DNA转移到受体细胞的源于RK2质粒的转移起点(oriT)、多个限制性酶切位点组成的多克隆位点(MCS)、紧挨着多克隆位点(MCS)上游的由硫链丝菌素诱导驱动的强启动子tipAp以及位于多克隆位点(MCS)下游的转录终止子tfd以防止转录的通读；它还包含如上所述的解酯酶基因attM。

所述多个限制性酶切位点包括NdeI，XbaI,BamHI,BglII。

所述解酯酶基因attM的核苷酸序列见DNA序列数据库Genbank，登录号U59485，该基因全长为771bp，G+C含量为57％，编码256个氨基酸的解酯酶蛋白。