[发明专利]一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法

说明书

一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，其特征在于：血清经过有机溶剂‑甲醇沉淀蛋白以后，然后离心、真空离心干燥，然后复溶于200 µL的纯水，引入反相色谱飞行时间质谱仪进行测定，经过峰对齐、校正和标准化、多变量统计分析和谱库检索可以找到喉癌志愿者和健康志愿者血清中的差异代谢物。本发明为全新的血清中差异代谢物的鉴定方法，通过差异代谢物可以反应喉癌患者血清代谢物的变化情况，将有助于喉癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。

技术领域：

本发明属于血清的理化检验技术领域，具体说是一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法。

背景技术：

常见的喉癌类型为鳞片状细胞癌，具有高发病率和高复发率的特点，且容易发生颈部淋巴结转移。在喉癌的治疗中主要采用手术为主的喉切术，并辅以放化疗，但其对于化疗不敏感，且容易引起患者发音、吞咽功能差，生存质量降低等问题，早期喉癌治疗效果较好而晚期喉癌疗效差，但对于喉癌的早期诊断仍然缺乏十分有效的生物标志物。因此，新的生物标志物的发现对于临床上实现喉癌的早期诊断和治疗具有重要意义。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢组学技术可以发现新的生物标志物，这将有助于头颈癌的诊断、临床治疗、预后判断及其发病机制的研究。

对于具有诊断功能的生物标志物的发现，往往采用非入侵或者少入侵的体液，如血液和尿液等。尿液中包含许多的代谢终产物，以及营养物质、药物和外源性物质的代谢物，而血液反应的往往是一些内生性的代谢物。但是对于临床诊断，往往多采用血液，这是因为24 小时尿液样本的收集比较繁琐和容易出错，晨尿中化合物的浓度容易受到受试者所摄入的液体（如饮料、水等）的影响，不能完全代表受试者当时的状态，而血液流过受试者的全身，能够很好的反应受试者的身体状况。目前，血清已经被广泛用于肺癌、鼻咽癌的差异代谢物的研究，而用于喉癌差异代谢物的研究还未见报道。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、选择性好的筛选喉癌志愿者和健康志愿者血清中差异代谢物的反相色谱飞行时间质谱方法，该方法能快速、准确鉴定血清中的差异代谢物。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于反相色谱飞行时间质谱的喉癌血清差异代谢物的测定筛选方法，是以喉癌志愿者和健康志愿者血清为样本进行测定、比较、筛选，具体包括以下工艺步骤：

a、血液在室温下解冻，移取400 µL的血清，加入1200 µL的甲醇，涡旋混合15 s，然后以15800 g离心力在离心机中离心15 min；

b、移取370 µL的上清液于2 mL的离心管中，然后于真空离心机中离心干燥，然后复溶于200 µL的纯水中，然后装入色谱瓶中待测；

c、反相色谱飞行时间质谱对所有血清样本进行逐一分析，得原始数据；

d、将原始数据转换为mzXML的格式后，对数据进行峰对齐、校正、滤噪后，采用SIMCA-P进行多变量统计分析，筛选VIP大于1的代谢物。

e、用SPSS进行T检验，对于P<0.05且VIP大于1的为潜在差异代谢物。

f、对于潜在差异代谢物，采用谱库检索或者标准品比对等方法进行验证，即为差异代谢物。