[发明专利]纯化同时复性大规模制备SA‑hGM‑CSF双功能融合蛋白

权利要求书

1.一种利用阴离子交换层析纯化柱同时复性SA-hGM-CSF双功能融合蛋白的方法，其特征在于包含以下方法：

(1)将SA-hGM-CSF融合蛋白包涵体进行洗涤溶解，获得SA-hGM-CSF融合蛋白粗制品；

(2)将步骤(1)所获得的SA-hGM-CSF融合蛋白进行柱上纯化同时复性以制备SA-hGM-CSF双功能融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其步骤(1)中所述的SA-hGM-CSF融合蛋白包涵体洗涤溶解的方法为：将SA-hGM-CSF包涵体按质量∶体积＝1∶20的比例依次用包涵体洗涤液A，B，C，D，E液分别溶解后放在磁力搅拌器上进行搅拌洗涤3h后用12,000rpm，4℃离心30min，去上清并用下一个洗涤液对沉淀进行重悬再洗涤。其中，C液可洗涤过夜。

将经过E液洗涤后离心所得的沉淀用8M脲素溶解液溶解过夜后用12,000rpm，4℃离心30min，弃去多余的沉淀得到的上清即为含有SA-hGM-CSF包涵体蛋白质的溶液。其中上述每一步均取上清留样进行跑SDS-PAGE胶观察结果。其中，包涵体洗涤液和溶解液配方如下：

(分别将包涵体洗涤液A，B，C，D，E以及8M脲素溶解液成分溶于800ml去离子水中，充分搅拌溶解后调节pH值至8.0，定容至1L。配好后的溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，放于室温保存。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的纯化同时复性的方法为：

将SA-hGM-CSF融合蛋白以2mg/ml的浓度上样到经平衡液(30mM Tris-HCl、1mM EDTA，6M脲素，pH＝7.9)平衡的阴离子交换柱上，经2cV的再平衡去除一定的杂蛋白后，线性逐步从100％平衡液换到100％复性液(30mM Tris-HCl、1mM EDTA，3mM GSH，1mM GSSG，1.5M脲素，30mM L-Arg，pH＝7.9)以形成脲素梯度从而诱导吸附于DEAE FF树脂上的SA-hGM-CSF融合蛋白复性，再运行2个柱体积的复性液以使平衡液被完全置换，最终用洗脱液将复性的该融合蛋白洗脱下来，收集洗脱峰，测定SA-hGM-CSF双功能融合蛋白的浓度及其生物活性。