[发明专利]免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）单状核细胞的获取；

（2）DC和T细胞的分选；

（3）DC扩增和疫苗的制备；

（4）T细胞培养和扩增，具体包括：取细胞培养瓶，加入含CD3单抗500ng/ml的无血清培养基AIM-V，将分选获得的T细胞加入培养瓶，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中过夜，次日半量补充含500IU/ml IL-2的AIM-V培养基（IL-2培养基），后每3天补充IL-2培养基40%以上，进行扩增培养；

（5）T细胞活化和Dual-block CTL制备，具体包括：第7天DC疫苗收获后，按DC:T=1:20的比例将DC疫苗加入T细胞培养瓶中共培养，使T细胞活化并制备成肿瘤特异性CTL效应细胞；第8天加入抗人PD-1单抗3-15ug/ml及抗人CTLA-4单抗3-15ug/ml，进行效应细胞免疫检测点双阻断，每3天补充IL-2培养基，培养10-15天收获肿瘤特异性Dual-block CTL效应细胞制剂，流式检测Dual-block CTL表面PD-1及CTLA-4的表达持续低水平；所述效应细胞选自T细胞来源的各种CTL、TIL、NK、CIK、以及各种T细胞亚型等细胞。

2.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括：静脉抽取或血液成分分离机采集肿瘤病人外周血单状核细胞或脐血造血干细胞100ml，离心收集全血细胞，移入淋巴细胞分离液，水平转头离心2000rpm×15分钟，吸取中间白膜层，加入生理盐水吹打混匀，1500r/min离心5分钟，弃上清，洗3遍，收集的细胞为单状核细胞。

3.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体包括：将收集的单状核细胞移入含无血清培养基的培养瓶中，置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，粘附于瓶底的DC细胞另行培养，制备DC疫苗；吸取悬浮T细胞移入新培养瓶另行培养。

4.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括：上述贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF为1000IU/ml和IL-4为600IU/ml的AIM-V培养基20ml，置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中扩增培养；第3天补液，第5天加入特异性肿瘤抗原50ug/ml，第7天收获特异性DC疫苗。

5.根据权利要求4所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述肿瘤抗原选自病人自体肿瘤抗原、各种抗原肽、融合肿瘤细胞抗原、凋亡肿瘤细胞抗原、衰老肿瘤细胞抗原、各种重组蛋白、肿瘤DNA、肿瘤RNA。

6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，IL-2培养基中加入10U/ml的IL-15。