[发明专利]三联人工miRNA抑制VEGFRs制备及其应用有效
| 申请号： | 201610717422.X | 申请日： | 2016-08-24 |
| 公开（公告）号： | CN106282212B | 公开（公告）日： | 2020-03-10 |
| 发明（设计）人： | 黄剑飞;王志伟;咸云;曹学敏;李洁莹;张筱静 | 申请（专利权）人： | 南通大学附属医院 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/66;A61K31/7105;A61K48/00 |
| 代理公司： | 南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙) 32249 | 代理人： | 徐激波 |
| 地址： | 226000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 三联 人工 mirna 抑制 vegfrs 制备 及其 应用 | ||
1.三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体在制备用于治疗胰腺癌药物中的应用；所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNATM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用；其中VEGFRs基因人工miRNA的碱基序列如下表：
Gene Sequence(5’-3’) Gene Accession No. Location VEGFR1 GCCTCTGATGGTGATTGTTGA NM_002019 2987 VEGFR2 GAGAATCAGACGACAAGTATT NM_002253 2308 VEGFR3 TTAACTCAGGTGTCACCTTTG NM_002020 833
。
2.三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1)通过引物miRNA-1F、1R扩增miRNA-1表达框，采用凝胶回收PCR产物，目标载体采用pSilence4.1-CMV/neo载体和miRNA-1表达框PCR回收产物分别采用EcoRI和NheI酶切，连接PCR产物至酶切好的pSilence4.1-CMV/neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo中间载体；
2)通过引物miRNA-2F、2R扩增miRNA-2表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo和miRNA-2表达框PCR回收产物分别采用KpnI和HindIII酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo中间载体；
3)通过引物miRNA-3F、3R扩增miRNA-3表达框，采用凝胶回收PCR产物，pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo和miRNA-3表达框PCR回收产物分别采用KpnI和NheI酶切后，克隆至酶切好的pcDNA6.2-miRNA1-miRNA2/GFP-Neo线性载体中，测序正确，成功构建pcDNA6.2-Tri-miRNA/GFP-Neo载体；
所述的三联人工miRNA抑制VEGFRs的载体，在pcDNATM6.2-GW/miR载体中构建有分别针对3个目的基因VEGFR1、VEGFR2，VEGFR3的人工miRNA，所述的3个人工miRNA通过串联形式，连接到psliencer4.1的骨架载体，形成三联amiRNA载体，发挥同时沉默VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3这三个基因的作用；其中VEGFRs基因人工miRNA的碱基序列如下表：
Gene Sequence(5’-3’) Gene Accession No. Location VEGFR1 GCCTCTGATGGTGATTGTTGA NM_002019 2987 VEGFR2 GAGAATCAGACGACAAGTATT NM_002253 2308 VEGFR3 TTAACTCAGGTGTCACCTTTG NM_002020 833
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