[发明专利]一种寡聚核苷酸的纯化方法及应用有效

专利信息
申请号: 201610721169.5 申请日: 2016-08-25
公开(公告)号: CN106632558B 公开(公告)日: 2019-09-13
发明(设计)人: 陈平;王翔;胡华友;支三军 申请(专利权)人: 淮阴师范学院
主分类号: C07H21/02 分类号: C07H21/02;C07H21/04;C07H1/06
代理公司: 北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11690 代理人: 张丹
地址: 223300 *** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 核苷酸 纯化 方法 应用
【说明书】:

本发明提供了一种对经DNA合成仪合成的寡聚核苷酸进行纯化的方法,包括以下步骤:采用C18反相柱或固相萃取纯化柱对粗DNA进行纯化,其中以非极性键合硅胶或弱极性键合硅胶为固定相或使用寡聚核苷酸固相萃取纯化柱填料为载体,以乙腈/水,和/或浓氨水,和/或去离子水,和/或三氟乙酸,为流动相进行洗脱纯化,收集目的寡聚核苷酸溶液,将所收集的DNA溶液进行浓缩。通过本方法纯化得到的寡聚核苷酸纯度高,收率高,并且本方法操作简单,成本低。

技术领域

本发明涉及寡聚核苷酸的纯化领域,特别是带有或未带有二甲氧基三苯甲基(DMT)的寡聚核苷酸的纯化。

背景技术

DNA合成仪已经是获得寡核苷酸的一种非常有价值的工具。寡核苷酸是分步合成的,每隔一定时间向新生成的寡核苷酸链上加上一种单体。在每一反应周期中几乎定量地对寡聚核苷酸链进行增链反应,但仍会有约1-2%左右的单体不能反应完全。因此所得产物一般含有少量的不同长度寡聚核苷酸杂质链的不均匀混合物。

一般而言在固相载体(CPG)上制备寡聚核苷酸需要将最终目标寡聚氧核苷酸链从载体上解脱下来。将该寡聚物从载体上解脱下来一般是用浓氨水处理该固相载体。通常还需要再用例如旋转蒸发器等仪器在减压条件下去除过量的氨水。但是这种去除浓氨水的方法不宜用于大规模分离寡聚核苷酸粗产品。

事实上,就这个问题,本领域中已经展开了一些研究,Metelev等(1992)报导了用离子交换HPLC分析寡核糖核苷酸和嵌合的寡核糖-寡脱氧核糖核苷酸。他们发现所研究的寡核苷酸的保留时间取决于寡核苷酸中核糖核苷酸残基的数目。并发现寡核糖核苷酸的保留时间与其长度有关。Metelev指出可以纯化和分析长度高达25个核苷酸的寡核糖核苷酸。

PCT专利申请WO2011/161007提出的纯化方法首先在反相高效液相色谱法采用酸性RP-HPLC流动相,随后采用高pH值的流动相。然而高pH值条件下多肽不稳定,产生新的杂质,导致批次之间纯度不一致。

此外,有报道称 (Journal of Medicinal Chemistry 43,1664-1669,2000)采用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN),流动相为标准的TFA/乙腈体系,柱温为65度,乙腈的浓度梯度为60分钟内0~100%,分离出目标产物,纯化收率为35%;中国专利200610110898.3和中国专利200510107588采用同样的纯化方法,纯化收率为28%。

目前,绝大多数寡聚核苷酸引物均采用OPC(oligonucletide purificationcartridge,寡聚核苷酸固相萃取纯化柱)柱纯化、HPLC(高效液相色谱)纯化以及PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯化三种纯化方法,但是这三种纯化方法均有其不足之处:HPLC虽然纯度较高,但是它的纯化量较小,速度慢且费用高;OPC柱纯化,虽然速度较HPLC有所提高,但是其专一性吸附能力有限,不免有小片段的带入;PAGE纯化虽然纯化效果较好,而且可以直观的看到DNA合成片段的质控环节,但是PAGE纯化实验步骤多、费人力、电泳及后处理过程样品损失量大以及电泳时间长,纯化时间长达6-8小时,这样对于大量的DNA纯化势必受到一定的影响。

因此,现在需要有适用于制备寡聚核苷酸链分离纯化的改进方法。

发明内容

发明概述

本发明提供了寡聚核苷酸纯化的改进方法。具体地说,本发明提供的方法适合于对DNA合成仪获得的寡聚核苷酸链进行高效纯化。本发明纯化方法不需要使用减压去除浓氨水。

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