[发明专利]一种溶血栓药物rPA新的生产方法

权利要求书

1.一种制备溶血栓药物rPA的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

a)利用酵母菌分泌表达rPA，筛选获得高表达菌株；

b)利用酵母菌分泌表达配体刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)，筛选获得高表达菌株；

c)利用ETI作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质；

d)利用步骤c)所得的亲和层析介质对步骤a)所得的rPA进行亲和层析，分离纯化所述rPA。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)rPA高表达菌株的获得：

将rPA核苷酸序列，两端引入XhoI/NotI限制性酶切位点，插入表达载体，转化酵母菌，筛选高表达菌株；

(2)ETI高表达菌株的获得：

在ETI核苷酸序列的C末端引入组氨酸标签(His-tag)，然后两端引入XhoI/NotI限制性酶切位点，插入表达载体，转化酵母菌株，筛选高表达菌株；

(3)ETI亲和层析介质的制备：

将上述ETI高表达菌株发酵或摇瓶表达的ETI经固化金属离子亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)纯化，然后和溴化氰活化的亲和层析介质混合，制作ETI亲和层析柱；

(4)rPA纯化：

上述rPA高表达菌株发酵或摇瓶表达产物先经简单离心或过滤，上清液过ETI亲和层析柱，冲洗后洗脱，收集洗脱液，即得所述rPA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母菌株；优选地，所述毕赤酵母菌株为GS115，SMD1168等。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母分泌表达载体；优选地，所述毕赤酵母分泌表达载体为pPICZαA载体、pPICZαB、pPICZαC、或pPIC9K。