[发明专利]一种应用于丝状真菌中特异性沉默基因的干扰质粒pHX-RNAi

说明书

本发明公开了一种应用于丝状真菌中特异性沉默基因的干扰质粒pHX‑RNAi，该质粒包括一个完整的潮霉素抗性基因表达盒，一个草酸青霉来源的启动子，一个草酸青霉来源的内含子结构；该干扰质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了该质粒在丝状真菌草酸青霉菌中对一些很难敲除的基因进行单基因或多基因表达沉默的应用。本发明以草酸青霉中淀粉酶基因amy15A为例，证实了了干扰质粒pHX‑RNAi的高效稳定性，并以amy15A和cel7A‑2双基因干扰为例，验证了载体pHX‑RNAi用于多基因沉默的优势。SDS‑PAGE，酶活测定以及RT‑qPCR检测结果表明RNA干扰在转录后水平发挥了显著且稳定的作用，预示该干扰质粒在丝状真菌中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种用于真菌中基因改造的载体，尤其涉及一种在丝状真菌中对难敲除的特定基因进行单基因或多基因沉默的载体，即一种应用于丝状真菌中特异性沉默基因的干扰质粒pHX-RNAi，属于基因工程领域。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)或MicroRNA((miRNA)诱发的转录后基因沉默机制，它通过机体切割dsRNA使mRNA降解进而影响目的基因表达(Fire A,Xu S,Montgomery MK,Kostas SA,Driver SE,etal.1998.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans.Nature 391:806-811.)。RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，因此该技术被广泛用于探索基因功能和医疗研究领域。

RNAi广泛存在于真核生物中，它能特异性使靶标基因沉默，在动植物中该技术已发展成为一种新型的基因治疗方法；在真菌中，基因沉默更多是通过同源重组进行基因敲除的方式来实现的。但是由于丝状真菌中存在多核和易发生非同源重组的现象，传统的基因敲除手段并不能很好地发挥作用，特别是研究一些致死基因时，必须使基因部分沉默来分析其功能，在这种情况下，与难度高、操作复杂、周期长的基因敲除等传统的基因改造手段相比，RNAi技术更具有特殊的意义。

RNAi的发生需要生成dsRNA，目前生成dsRNA主要有两种策略，一种是体外合成dsRNA然后直接导入体内，这种方法在动物中经常被使用，但在真菌中这一技术应用还不广泛，并且干扰效果不稳定；另一种策略就是通过在基因组上插入一段序列，使其转录后形成双链或发卡结构的RNA，从而起到干扰目的基因的作用(Liu H,Cottrell TR,Pierini LM,Goldman WE,Doering TL.2002.RNA interference in the pathogenic fungusCryptococcus neoformans.Genetics 160(2):463-470.)。Nakayashiki等应用第二种策略构建了在子囊真菌的通用表达载体psilent-1(Nakayashiki H,Hanada S,Nguyen BQ,Kadotani N,Tosa Y,et al.2005.RNA silencing as a tool for exploring genefunction in ascomycete fungi.Fungal Genet Biol 42(4):275-283.)，在Magnaportheoryzae和Colletotrichum lagenarium中对增强绿色荧光蛋白eGFP等基因进行干扰，发挥了较好的作用。psilent-1质粒上含有功能元件的多拷贝现象(两拷贝的trpC的启动子及终止子)，实际应用时很可能会导致在青霉中的作用发挥不稳定。

发明内容

针对丝状真菌中有些基因的沉默不能直接用敲除的手段实现的现状，本发明要解决的问题是提供一种应用于丝状真菌中特异性沉默基因的干扰质粒pHX-RNAi。