[发明专利]一种棘白菌素 B 生产菌高产菌株的筛选方法

说明书

本发明建立了一种高效的棘白菌素B生产菌高产菌株的筛选方法，并对筛选所得菌株进行了保藏。首先根据棘白菌素B产生菌产物反馈抑制的特性，在筛选平板中加入适量的棘白菌素B作为初筛，筛选出消除产物反馈抑制的菌株。其次，将诱变菌株的菌丝体浸泡于有机溶剂中提取其中的棘白菌素B，再利用棘白菌素B对白色念珠菌的抑菌作用，根据抑菌圈大小，从初筛菌株中再次筛选棘白菌素B高产菌株，达到复筛的目的，最终将筛选出的高产菌株用发酵摇瓶考察其生产能力。该筛选方法简便高效，大大的缩短了筛选周期，提高了菌种筛选效率。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种棘白菌素B生产菌高产菌株的筛选方法。

背景技术

20世纪70年代人类发现了棘白菌素类药物，是一种构巢曲霉的次级代谢产物，主要有三种类型，其中棘白菌素B(Echinocandin B)是最为重要的类型。其分子结构中包含一个带有脂类侧链的环状六肽核，该脂类侧链能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用，表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物，主要作用于念珠菌属(Candidas)和曲霉菌属(Aspergillus)。

现在使用的棘白菌素B的生产菌株产量较低，增大了下游药物提取的难度，产品质量不高。因此，高产菌株的获得对棘白菌素B的发酵生产具有非常重要的意义。常规的自然选育周期长、效率低、随机性大以及大量筛选，导致很难获得优良特性菌株。而采用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，然后采用简便高效的筛选方法，从中选出良性突变菌株，成为菌种改良的主要方法。

本方法根据棘白菌素B产生菌产物反馈抑制的特性，在筛选平板中加入适量的棘白菌素B，作为初筛，筛选出消除产物反馈抑制的菌株。另外，由于棘白菌素B为胞内代谢物，采取将诱变菌株的菌丝体浸泡于有机溶剂中将棘白菌素B浸提，再利用其对白色念珠菌的抑菌作用，根据抑菌圈大小，从初筛选出的菌株中再次筛选棘白菌素B高产菌株，达到复筛的目的。最终将筛选出的高产菌株用发酵摇瓶考察其生产能力。该筛选方法简便有效，大大的缩短了筛选周期，提高了效率。

发明内容

本发明通过大量实验研究，目的在于提供一种棘白菌素B生产菌-构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)高产菌株的筛选方法。所述筛选方法最终筛选得到了一种棘白菌素B生产菌高产菌株，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8987，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

所述筛选方法为：通过消除产物反馈抑制对诱变菌株进行初筛，然后根据对白色念珠 菌的抑菌圈大小来达到复筛的目的，最后对筛选出的优良菌株用发酵摇瓶考察其生产能力。具体步骤如下：

(1)将适当稀释处理的构巢曲霉菌孢子悬浮液经诱变处理后，涂布于筛选平板上，恒温培养。根据产物反馈原理，如果诱变菌株在含有棘白菌素B的筛选平板上生长良好，说明有可能消除了反馈抑制，可能为高产菌株，将其做好标记，挑取半个菌落浸于有机溶剂中，将菌株胞内的棘白菌素B浸提,而剩余半个菌落做菌种保藏。

(2)从步骤(1)中的浸提液中，取10微升加入小滤纸片。将其置于长好白色念珠菌的平板上,并做好标记。28℃培养24小时后，观察抑菌圈大小，从初筛获得的菌株中再次筛选出抑菌圈大的菌株，达到复筛的目的，并根据标记将对应的步骤(1)中保存的半个菌落进行传代培养。

(3)将步骤(2)中所筛选的菌株经过传代培养后，制备成种子液接种于发酵摇瓶。26℃280rpm培养6天后，检测发酵单位。

上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中所述诱变方法为紫外线诱变、NTG诱变、离子束诱变。