[发明专利]一种生防真菌黑附球菌H5及其应用

说明书

本发明涉及一种生防真菌黑附球菌H5及其代谢产物的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种生防真菌黑附球菌（Epicoccum nigrum）H5，保藏号为CGMCC NO.9713。该菌株从哈密瓜病变的表皮中分离得到，其次级代谢产物含有抑菌物质，对多种病原真菌都有强烈的拮抗作用，尤其对镰刀菌、灰霉菌等引起的采后果蔬病害有较好防效。该菌株的分离为微生物源保鲜剂的研发提供了优秀的原材料。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株防治果蔬采后病害的生防真菌黑附球菌H5及其代谢产物的应用。

背景介绍

目前，我国每年采后约有8000万吨的果蔬腐烂，造成近800亿元的经济损失。因此，通过发展贮藏或防腐技术以延长或保持果蔬品质，已成为重要的食品科学研究课题。采后病原微生物的侵染是造成采后腐烂损失的最主要原因。其中，植物病原真菌引起的病害占有较高比例，包括镰刀菌属、灰葡萄孢属、青霉属、链格孢属等。

目前，控制果蔬采后病害最有效的措施仍是化学杀菌剂处理，但长期使用不但容易引起抗药性导致的防效降低，而且果蔬上农药残留量增加容易带来食品安全问题。果蔬采后生物防治技术是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农产品不造成危害的微生物或产物来抑制引起采后腐烂的病原微生物的生长，从而减少采后损失，是非常有发展潜力的一种保鲜方法。采后病害生物防治的拮抗机理主要表现为抗生、竞争、寄生及诱导抗性等，其中，生防菌利用自身分泌的抗菌物质抑制病原菌生长是一种广谱高效的途径。

要利用生物防治技术进行果蔬保鲜，关键是获得具有显著拮抗效果的微生物或其产物。黑附球菌属于半知菌亚门附球菌属（Epicoccum Link），广泛存在于空气、土壤及衰老或幼嫩的植物组织表面，能够在衰老的或刚死亡的植物组织表面迅速产生分生孢子，并能产生抗菌化合物，因此被广泛应用于防治农作物病害。此外，针对黑附球菌属次生代谢产物的分离和提取、以及降解亚麻提取其中的纤维素用于生产都是其应用领域研究的热点，但针对用于果蔬采后生物防治的应用，目前研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一株用于果蔬采后病害生物防治的黑附球菌H5，该菌株对镰刀菌属（Fusarium. spp）、灰葡萄孢属（Botrytis. spp）及链格孢属（Alternaria. spp）等真菌有较强拮抗作用，该菌株的分离为微生物源保鲜剂的研发提供了优秀的原材料。本发明提供的黑附球菌H5，属半知菌亚门附球菌属，分离自储藏期哈密瓜病变的表皮，于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，分类命名为黑附球菌（Epicoccum nigrum），菌种保藏编号为CGMCC NO.9713，保藏日期为2014年10月8日，该菌株ITS基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的黑附球菌H5的主要生物学特征为：在PDA培养基上生长时有气生菌丝，菌落呈土黄色，边缘不规则，有V形分支；分生孢子单生，球形或梨形，一般多胞，深金黄褐色，老熟后颜色变深，通常成熟孢子直径15～25 μm，有时可达50 μm。

本发明还提供了黑附球菌H5次生代谢产物及其制备方法。

所述黑附球菌H5的次生代谢产物通过以下方法制得：黑附球菌H5菌株活化后接种至PD液体培养液，避光培养30天，过滤除菌，上清液即为含有次生代谢产物的生防菌液。

所述黑附球菌H5的次生代谢产物还可通过以下方法制得：将活化后的黑附球菌H5接种至PD液体培养液中，25℃、200 rpm避光培养30天。将发酵液过滤除去菌丝，加入等体积乙酸乙酯，在分液漏斗中萃取三次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩获得膏状物即为活性代谢产物，用蒸馏水、甲醇或乙酸乙酯溶解。