[发明专利]干细胞制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫细胞细胞实验领域，尤其是一种干细胞制剂的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)可自我更新，具多向分化潜能，可塑性及体外分化能力强。MSCs可从骨髓、脂肪细胞、胎盘、脐带、脐带血、胰腺、牙胚及羊水中分离获得，是再生医学的良好细胞类型。MSCs不表达CD34和CD45，免疫源性低，可被“免疫豁免”，因此可将异体MSCs用来移植，而无需进行组织配型。MSCs最具特点的作用机制，是通过免疫调节作用，发挥抗炎作用，降低炎症反应和抗细胞凋亡作用，而最终改善损伤组织功能。MSCs通过旁分泌作用，分泌各种细胞因子，调节局部微环境，使得损伤细胞保存生理功能。相关的细胞因子如VEGF等，在心血管疾病中可以加强MSCs的迁移与归巢，促进血管生成，降低缺血性心肌凋亡的发生，减少心肌梗死的范围。而在安全性和有效性方面，大量的临床前及临床试验显示，MSCs移植对心血管疾病具有治疗作用，并且是安全的。肝病方面的动物实验及人体试验表明，MSCs移植可以减缓肝硬化进程，并不同程度的逆转肝纤维化，改善肝脏合成功能，延长患者寿命，提高获得肝脏移植的机会和成功率。干细胞潜在治疗领域广泛，如血液系统疾病(如白血病)、神经系统疾病(如帕金森症)、心血管疾病(如心肌梗死)、肝脏疾病(如肝硬化症)、内分泌疾病(如糖尿病)等，目前各国都在争先进行相关研究。

近来，脐带间充质干细胞成为研究的热点。脐带MSCs来源广泛，易获得，并具有MSCs的所有特性。与骨髓来源的MSCs进行对比，脐带间充质干细胞更高水平表达CD146，一种代表MSCs的多向分化能力的标志物，且分化增殖能力更强。脐带间充质干细胞在慢性脊髓损伤的临床治疗研究结果显示，接受治疗的患者改善明显，生活质量得到很大提高，而不良反应发生率低，是非常安全的治疗方法。

最后，将脐带MSCs的作用做进一步的研究，并将其发展为安全有效的临床应用技术，真正地做到为人类造福。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种干细胞制剂的制备方法，本方法能够建立稳定的大规模间充质干细胞的培养体系；本方法能够建立稳定的干细胞制剂制备流程；本方法能够最适储存环境。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种干细胞制剂的制备方法，步骤如下：

⑴取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA,抗-HDV，抗HEV，抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA,CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带备用；

⑵将脐带从采集瓶中取出，置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成3-7cm的小段；

⑶将脐带段浸没于无菌烧杯中，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后的PBS基本无色为止；

⑷将清洗后的脐带转移到弯盘中，使用手术剪或手术刀将其剪切成1-5mm的小块，均匀平铺到T75培养瓶底部；

⑸将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；

⑹往培养瓶中缓慢加入含10％添加物的培养基，培养基的用量为浸没组织块且液面平齐；

⑺每6天换液1次，期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至80％左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；

⑻将间充质干细胞细胞传至P3代时，按8000cells/cm²的密度接种于T175培养瓶中，加入25ml的DF12完全培养基；

⑼待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；

⑽吸尽PBS缓冲液，加入5mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；

⑾用移液管移取两倍胰蛋白酶量的培养基至培养瓶中，终止消化；

⑿收集细胞悬液，1200rpm，9升8降离心6min；

⒀用移液管将离心后的上清液移弃，用40mL生理盐水重悬细胞，注意轻轻吹打，避免产生气泡，离心，重复操作4次；

⒁最后一次离心后，用移液管将离心后的上清液移弃，用10mL生理盐水重悬细胞，细胞筛过滤细胞悬液；

⒂取0.1mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积；

⒃取1*10⁶细胞悬液做流式；

(17)取100mL无菌生理盐水，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水；