[发明专利]在果蝇细胞中高表达人GAD65蛋白的基因序列和蛋白制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于人GAD65蛋白高效表达和制备技术领域，具体涉及承载GAD65果蝇细胞高表达基因序列和GAD65高效制备技术。

研究背景：

谷氨酸脱羧酶(Glutamic Acid Decarboxylase,GAD65)是一种重要的胰岛自身抗原，其蛋白制品可广泛应用但不局限于胰岛自身抗体(谷氨酸脱羧酶抗体,GADA)检测，抗原特异性T淋巴细胞检测和增殖，以及自身免疫糖尿病预防及治疗。

外源蛋白的表达往往与多种因素相关，包括转录和翻译的效率。在果蝇细胞中表达人GAD65蛋白，种属间密码子利用度的差异往往会降低外源蛋白的表达水平。本发明通过探讨密码子使用种属偏好性，分析并合成在昆虫S2细胞中表达人GAD65蛋白的最佳序列，最终提高重组蛋白的表达效率。

通过培养细胞，获得重组蛋白的表达仍然是大量生产蛋白质的重要方法之一。细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞以及目前已经开展的昆虫细胞的相关研究都各有其限制。在细菌中表达的重组蛋白缺乏正确折叠和翻译后修饰，往往导致重组蛋白的免疫原性较低。酵母表达外源蛋白的翻译后加工与哺乳动物有所不同，且不易进行高密度发酵。在昆虫Sf9，Sf21和High five细胞中可运用昆虫杆状病毒系统表达外源蛋白，但细胞感染后会被裂解，不能稳定连续培养，蛋白批间差异较大。哺乳动物细胞中表达外源蛋白成本高且表达量低。本发明运用果蝇S2细胞表达人GAD65蛋白，蛋白的翻译后加工与哺乳动物中非常相似，并且可高密度连续培养，大大降低成本并为后续纯化工艺的批间一致性提供保障。

纯化重组蛋白的常用标签为6His、GST标签等，但往往纯化后蛋白纯度不高，需要借助后续的分子筛、离子交换、疏水层析等手段将目标蛋白纯度提升至90％以上。在本发明中借助StrepII标签介导的亲和层析，可以通过一步亲和层析获得重组GAD65蛋白(纯度90％以上且具有良好的免疫原性)，大大提高了重组蛋白的得率。

发明内容：

本发明目的是提供在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白基因序列和GAD65蛋白高效制备的方法，该改造后的基因序列能够大大提高人GAD65蛋白的表达水平。高密度培养后的昆虫细胞裂解后通过一步亲和层析即可获得纯度90％以上的重组GAD65蛋白，有效降低成本和纯化过程中的损耗。纯化的GAD65蛋白经ELISA验证具有良好的免疫原性。

本发明在果蝇细胞中高表达的人GAD65蛋白的基因序列，如SEQ NO.1所示。

SEQ NO.2所示的序列为本发明如SEQ NO.1所示的人GAD65基因序列改造前的序列。

人GAD65蛋白的制备方法，将SEQ NO.1所示的序列联合StrepII标签克隆到表达载体中，再和抗性质粒同时转染到果蝇细胞中表达，将得到GAD65-StrepII标签融合蛋白。

所述的表达载体为pAc5.1/V5-His A。

所述亲和纯化标签为StrepII标签；所述的抗性质粒为pCoBlast抗性载体。

所述果蝇细胞为S2。

具体包括以下步骤：

(1)根据种属偏好性表达，运用OptimumGene软件对人GAD65的ORF序列进行密码子优化；

(2)人工合成全序列；

(3)引物和酶切位点设计：

根据合成的序列和StrepII标签设计引物，并加入KpnI和NotI酶切位点，引物如下所示：

forward primer：

5'-CGGGGTACCCAAACATGTGGTCGCATCCGCAGTTCGAGAAGGCCTCGCCAGGAAGCGG-3'；

reverse primer：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTACAGGTCCTGGCCCAGG-3’；

(4)PCR扩增获得目的GAD65-StrepII片段；

(5)对目的片段和载体进行双酶切；

(6)酶切后的目的片段和载体在T4连接酶作用下连接；

(7)重组转化:将重组表达载体转染细菌感受态细胞；

(8)测序验证后大量抽提表达GAD65-StrepII的载体

(9)将GAD65-StrepII载体与pCoBlast抗性载体共转染果蝇细胞表达蛋白

(10)步骤(9)获得的蛋白经过纯化后获得高纯度GAD65蛋白

步骤(5)中的载体为pAc5.1/V5-His A。