[发明专利]肿瘤干细胞的富集和筛选方法

说明书

本发明提供肿瘤干细胞的富集和筛选方法，所述方法是将成球培养和免疫磁珠分离法联合用于肿瘤干细胞的富集和筛选，具体如下：将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用QPCR法同步检测肿瘤干细胞标志物的相对表达水平，当其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选或双选筛选肿瘤干细胞。将两种筛选方法相结合，可显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及后续应用不便等实际问题。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及肿瘤干细胞的富集和筛选方法。

背景技术

传统观念认为，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长,肿瘤的发生、发展是全部肿瘤细胞共同增殖的结果。但这无法解释并非所有肿瘤细胞都能无限制生长的现象。肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)的理论。这一理论为人们重新认识肿瘤的起源和本质，以及临床肿瘤治疗提供了新的方向和视角。

近年的研究证实，在肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群体，这些细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)；CSCs可能是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。绝大部分的实体肿瘤被认为起源于肿瘤干细胞CSCs可能是导致肿瘤临床治疗原发性和获得性耐药的重要原因之一，因此，近年来对于肿瘤干细胞的研究吸引了国内外肿瘤基础科研的广泛关注。迄今为止，已经在脑肿瘤、肺腺癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤中发现了CSCs，进一步证实了CSCs理论。CSCs的生物学特性主要表现在以下方面：①具有自我更新能力，能够在体内外无限分裂增殖；②多向分化潜能，CSCs能够产生不同分化类型的子代细胞；③多处于细胞生长周期的G0期，长期保持休眠状态，因此常规化疗药物无法杀死数量极少且增殖不活跃的CSCs；④抗凋亡，CSCs高度表达抗凋亡基因Bcl-2；⑤具有端粒酶活性；⑥其生长发育受Wnt、Notch等信号通路转导调控；⑦耐药性，CSCs膜表面表达多种ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)，可以利用ATP水解提供的能量把药物泵出细胞外，使细胞免受药物的伤害。由此可见，对肿瘤干细胞展开深入研究确实对于推进肿瘤防治有至关重要的意义。

虽然目前有越来越多的证据支持CSCs理论，但仍然存在着制约对其进行深入研究的问题。其中最凸显的就是CSCs的分离技术仍不完善。目前，用于分离肿瘤细胞群体中干细胞亚群的方法主要有如下三种：

1、侧群细胞分离法。侧群细胞(Side population cells)首次发现于1996年，Margaret A.Goodell使用荧光染料Hoechst 33342活染骨髓细胞后进行流式分析，得到一群游离于主群之外的双阴性的细胞群。后续实验证明这群细胞具有可外排细胞染料Hoechst 33342的特点，且具有干细胞的特性。肿瘤侧群细胞具有肿瘤干细胞的特性，尤其具备肿瘤的始发潜能，同时对化疗药物有较强的抵抗能力。因此采用侧群细胞外排Hoechst33342的特性，可以用来分离和富集肿瘤细胞群体中的肿瘤干细胞。

2、成球培养法。成球培养法的原理是肿瘤干细胞被发现在无血清但富含一定细胞因子的培养条件下，可以成团生长繁殖，形成如葡萄串样的克隆肿瘤球，而普通肿瘤细胞在这个过程中无法良好增殖的这一特点，在成球培养过程中使干细胞得到占绝对优势的增殖，从而起到筛选和富集的作用。

3、免疫磁珠分离法。免疫磁珠分离法的原理是基于抗原抗体间的特异性结合。不同类型的肿瘤干细胞往往具有特异高表达的表面标志物，而利用对应的标志物抗体包被的磁珠(免疫磁珠)可以在磁场作用下，从细胞群体中筛选吸附出这类表面标志物高表达的细胞群体，从而达到筛选某类肿瘤干细胞的目的，如CD133/CD24免疫磁珠双阳筛选用来富集肾癌干细胞，CD133+/CD49f+免疫磁珠双阳筛选用来富集宫颈癌干细胞，CD133+免疫磁珠单选用来富集前列腺癌肿瘤干细胞等。