[发明专利]用于高等真菌基因中断的方法

权利要求书

1.一种用于高等真菌基因中断的方法，其特征在于，通过将含有密码子优化的Cas9基因的表达载体转入单倍体灵芝Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26中，获得可稳定表达Cas9蛋白的灵芝菌株；然后采用体外转录的方式，将经体外转录的gRNA转入此表达Cas9蛋白的灵芝菌株中，通过gRNA识别靶向基因，实现靶向基因的特定位点的中断；或采用内源转录的方式，以U6 snRNA启动子介导gRNA内源转录，同样使靶向基因的特定位点中断；

所述的Cas9基因，含有SV40 NLS核定位信号，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述的gRNA为针对灵芝ura3基因序列设计的靶向识别序列，具体为：

用于体外转录的gRNA1序列，即5’ GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3’，具体如SEQ ID No.26所示，或gRNA2序列，即5’ GGCCTCTTCCGTGTATGAGC 3’ ，具体如SEQ ID No.27所示，或

用于内源转录的gRNA3序列，即5’ AACCGGCTCATACACGGAAG 3’ ，具体如SEQ ID No.25所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的体外转录，即构建gRNA1和gRNA2体外转录的DNA模版，通过MEGAscript T7进行体外转录。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DNA模板，通过以下方式得到：使用人工合成gRNA的方法，并合成打靶同源片段序列，选用目标基因为ura3基因不同位置的两种gRNA序列以及如Seq ID No.10所示的正向引物Glura-F1和如Seq ID No.11所示的反向引物ble-R扩增获得目标片段，PCR产物纯化回收后通过TA克隆连接于pMD-18T骨架中，通过转化大肠杆菌DH5α并挑取转化子，得到pMD-gRNA1质粒，或采用相同方式以如Seq ID No.12所示的正向引物Glura-F2以及如Seq ID No.11所示的反向引物ble-R得到pMD-gRNA2质粒；最后使用如Seq ID No.13所示的正向引物以及如Seq ID No.14所示的反向引物扩增，从而分别获得gRNA1和gRNA2体外转录的DNA模版。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内源转录，即根据具有RNApolymerase III活性的灵芝内源的U6 snRNA启动子构建内源gRNA表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通过MEGAscript T7进行内源转录。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的内源gRNA表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通过以下方式得到：通过如Seq ID No.17所示所示的pU6-1和如Seq ID No.18所示的pU6-4基因，分别对应采用如Seq ID No.19所示的正向引物U6-F1和如Seq ID No.20所示的反向引物U6-R1以及采用如Seq ID No.21所示的正向引物U6-F4和如Seq ID No.22所示的反向引物U6-R4分别通过PCR扩增出U6-1启动子和U6-4启动子；然后通过如Seq IDNo.23所示的正向引物sgRT-F和如Seq ID No.24所示的反向引物sgRT-R扩增出gRNA末端序列，使用XmaI，SphI，BsaI酶切上述片段后，用T4连接酶连接到pUC19表达载体上，从而构建出表达载体pUC-U6-1和pUC-U6-4；最后使用BbsI酶切上述载体，将退火形成双链的gRNA3，即Seq ID No.25连接到表达载体上，得到gRNA内源表达载体pU1-gRNA3和pU4-gRNA3。

6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于，所述的Cas9基因的表达载体，为pMD-Glcas9质粒，其骨架为pMD18-T，且含有上述Cas9基因、启动子Pgpd、终止子Tpdc以及选择标记基因sdhB。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的启动子Pgpd为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的gpd组成型启动子；所述的终止子Tpdc为：来源于木霉Trichoderma reesei的pdc终止子；所述的选择标记基因sdhB为：来源于灵芝Ganoderma lucidum的sdhB点突变基因。