[发明专利]结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941及其T细胞表位肽在结核病检测试剂、疫苗和药物制备中的应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，调查结果显示全世界有三分之一的人口处于潜伏感染，且有5％～10％在未来的生活中将可能发展为活动性结核病。自1993年世界卫生组织宣布结核病成为全球危机后，结核病的发病率和死亡率一直居高不下，据WHO报告，每年新增结核病人约800万，每年约有200～300万人死于结核病。我国在22个结核高负担国家中位居第2位，全国第5次流行病学抽样检查结果显示：全国130万人发病，占全球发病率的14.3％，我国也是全球27个耐药结核病高负担国家之一，耐多药结核病患病人数占据全球第一。每个未经治疗的活动性肺结核病人能够传染10～15人。结核病已经成为全球重要的卫生问题，需引起人们的高度重视。

结核的早期诊断和预防治疗对结核病的控制至关重要，临床上常用的是细菌学方法痰涂片镜检和痰培养，痰涂片镜检是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，由于此法设备简便，适合在经济不发达的地区使用。但是由于对样本中的菌含量要求高，因此该方法灵敏度不高，导致大量涂阴患者不被发现从而转阳，且涂阴患者具有传染性，不容忽视，该方法无种特异性，灵敏度差，受痰液标本和病情的影响。痰培养作为结核病诊断的金标准，但是存在培养时间过长，现在已有BACTEC MGIT960系统等快速培养系统可在2周内分离培养结核分枝杆菌，但由于其配制的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格昂贵，无法在发展中国家广泛推广，并且快速培养与改良L-J培养相比污染率显著增高，导致假阳性结果出现。常用的用于人群筛查的检测方法是皮肤结核菌素实验，使用的是结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有许多分枝杆菌种类(致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性较差，不能有效区分结核分枝杆菌感染与卡介苗接种，结核的影像学检查如常规的X线检查、CT检查、MRI检查、超声检查等价格昂贵，且对身体造成一定伤害，特异性低，不适合用于常规的检查诊断。

结核分枝杆菌侵入人体后寄居在巨噬细胞内，人体对结核分枝杆菌主要的免疫反应是细胞免疫应答，主要参与的细胞是CD4+和CD8+T细胞。CD8+T细胞可以通过穿孔素、颗粒酶等途径将被结核分枝杆菌感染的巨噬细胞或树突状细胞杀死从而达到清除结核分枝杆菌的目的。感染结核分枝杆菌的人再次接触结核分枝杆菌特异性抗原时，T淋巴细胞增殖产生IFN-γ，通过单克隆抗体检测出IFN-γ即可确定曾经或正在感染结核分枝杆菌。

目前以T细胞为基础的检测方法T-SPOT是利用IFN-γ特异性抗体捕获经结核抗原刺激的外周血淋巴细胞培养后产生的IFN-γ，并以酶联免疫斑点显色的方式表现出来，从斑点的数量来确定细胞分泌细胞因子的情况，从单细胞水平评价细胞免疫功能。以T细胞为基础的体外γ干扰素的检测被用于结核病的辅助诊断，该检测方法不仅能筛选出活动性结核病人，同时也能检测出潜伏期病人，从而能更好的预防和控制潜伏期结核，目前已有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽为刺激物的商品化的IGRA检测试剂盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈现较高的灵敏性和特异性，但是尚未达到结核病的诊断需求。

Rv2941(GI:15610078)位于H37Rv基因组上，全长1743bp，编码含有580个氨基酸的蛋白，是脂肪酸AMP合成酶，利用生物信息学软件对其进行抗原表位预测分析，发现Rv2941蛋白存在较多的T细胞表位，具有潜在的诊断效能。

本发明建立在反向疫苗学的基础上，利用计算机筛选出结核分枝杆菌可能的免疫原性抗原库，然后利用生物信息学软件TE predict和IEDB预测结核抗原MHC-I类T细胞表位，通过固态合成法合成这些多肽，先利用人群免疫筛选试验对结核新抗原进行筛选，筛选出免疫优势抗原之后，再通过动物实验对其免疫原性进行验证，最后经验证得到的免疫优势抗原可一方面用于结核诊断，另一方面可用于卡介苗的改造。

发明内容

本发明的目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941的应用。

本发明的另一目的是提供结核分枝杆菌抗原蛋白Rv2941 T细胞表位肽及其应用。