[发明专利]结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0585c及其T细胞表位肽的应用

说明书

本发明涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0585c及其T细胞表位肽在制备结核检测试剂、疫苗和药物中的应用，所述表位肽选自P24、P26和P31，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明利用结核分枝杆菌Rv0585c蛋白抗原及其T细胞表位肽作为刺激物用于结核分枝杆菌感染引起的特异性T细胞和B细胞免疫反应，与以往采用完全抗原相比，能够降低由于抗原不纯造成的假阳性。由所述Rv0585c蛋白抗原及其表位肽制备的检测试剂可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。Rv0585c蛋白抗原及其T细胞表位肽制备的结核疫苗和抗结核药物可用于结核病的预防和治疗。

技术领域

本发明涉及分子生物学和免疫学领域，具体地说，涉及结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0585c及其T细胞表位肽在结核病检测试剂、疫苗和药物制备中的应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病，调查结果显示全世界有三分之一的人口处于潜伏感染，且有5％～10％在未来的生活中将可能发展为活动性结核病。自1993年世界卫生组织宣布结核病成为全球危机后，结核病的发病率和死亡率一直居高不下，据WHO报告，每年新增结核病人约800万，每年约有200～300万人死于结核病。我国在22个结核高负担国家中位居第2位，全国第5次流行病学抽样检查结果显示：全国130万人发病，占全球发病率的14.3％，我国也是全球27个耐药结核病高负担国家之一，耐多药结核病患病人数占据全球第一。每个未经治疗的活动性肺结核病人能够传染10～15人。结核病已经成为全球重要的卫生问题，需引起人们的高度重视。

结核的早期诊断和预防治疗对结核病的控制至关重要，研究者应致力于开发高效、敏感、特异的结核诊断检测方法。临床上肺结核症状表现为咳嗽、咳痰、高热等，容易与慢性支气管炎、支气管扩张、肺炎、感冒等混淆，需要借助影像学、细菌学、免疫学等诊断方法方可确诊。临床上常用的是细菌学方法痰涂片镜检和痰培养，痰涂片镜检是世界范围内结核病检查中使用最广泛的技术，由于此法设备简便，适合在经济不发达的地区使用。但是由于对样本中的菌含量要求高，因此该方法灵敏度不高，导致大量涂阴患者不被发现从而转阳，且涂阴患者具有传染性，不容忽视，该方法无种特异性，灵敏度差，受痰液标本和病情的影响。痰培养作为结核病诊断的金标准，但是存在培养时间过长，现在已有BACTECMGIT960系统等快速培养系统可在2周内分离培养结核分枝杆菌，但由于其配制的培养基、营养添加剂、杂菌抑制剂价格昂贵，无法在发展中国家广泛推广，并且快速培养与改良L-J培养相比污染率显著增高，导致假阳性结果出现。常用的用于人群筛查的检测方法是皮肤结核菌素实验，使用的是结核菌纯蛋白衍生物(PPD)，由于PPD中含有许多分枝杆菌种类(致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性较差，不能有效区分结核分枝杆菌感染与卡介苗接种，结核的影像学检查如常规的X线检查、CT检查、MRI检查、超声检查等价格昂贵，且对身体造成一定伤害，特异性低，不适合用于常规的检查诊断。

目前以T细胞为基础的检测方法T-SPOT是利用IFN-γ特异性抗体捕获经结核抗原刺激的外周血淋巴细胞培养后产生的IFN-γ，并以酶联免疫斑点显色的方式表现出来，从斑点的数量来确定细胞分泌细胞因子的情况，从单细胞水平评价细胞免疫功能。以T细胞为基础的体外γ干扰素的检测被用于结核病的辅助诊断，该检测方法不仅能筛选出活动性结核病人，同时也能检测出潜伏期病人，从而能更好的预防和控制潜伏期结核，目前已有以结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10的全蛋白或多肽为刺激物的商品化的IGRA检测试剂盒，如QuantiFERON-TB Gold test和T-SPOT，均呈现较高的灵敏性和特异性。而Rv0585c(GI:15607725)是H37Rv基因组上的基因，基因全长2388bp，编码795个氨基酸，是一种保守膜蛋白，目前功能未知，可能是一种结核毒力相关蛋白，Rv0585c在结核分枝杆菌复合群中存在，利用生物信息学软件对其进行抗原表位预测分析，发现Rv0585c蛋白存在较多的T细胞表位，具有潜在的诊断效能。