[发明专利]假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分的测定方法，具体涉及假马齿苋总皂苷提取物有效成分含量的测定方法。

背景技术

假马齿苋是玄参科植物假马齿苋Bacopamonnieri(L.)Wettst的全草，又名白花猪母菜。具有清热凉血，解毒消肿之功效。假马齿苋主要活性部位为其皂苷类有效成分，Bacopaside I等五个皂苷化合物，(达玛烷型三萜皂苷化合物Bacopaside I(BM28)，Bacoside A₃(BM37)，Bacopaside II(BM29)，Bacopasaponin C isomer(BM35i)及Bacopasaponin C(BM35)，五个皂苷成分结构式如下：

但是，对于上述有效成分的测定方法至今未有报道，为确保假马齿苋总皂苷提取物的质量稳定性，应建立相应的检测方法以及质量控制标准。高效液相色谱(HPLC)具有分离效能高、灵敏度高、重现性好、分析速度快等优点，在中药定量分析中已被广泛应用。因此，宜研究采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的方法。

本发明提供了假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量的测定方法。

本发明采用高效液相色谱(HPLC)测定假马齿苋总皂苷提取物的有效成分含量。

本发明方法包括下列步骤：

一、仪器与试药

(一)仪器

Agilent-1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KS5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；BP211D型电子天平(德国Sartorius)；Milli-Q50 SP纯水系统(美国Millipore公司)。

(二)试剂

乙腈(色谱纯，Merck公司)；磷酸(色谱纯，Tedia公司)；超纯水自制由Milli-Q纯水机(Merk Millipore)制得；其它试剂均为分析纯。

(三)供试品及标准品

取假马齿苋药材5kg置于多功能提取罐中，每次加入50kg的80％乙醇，提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩(-0.6Bar压力，60℃)至无醇味，加95％乙醇调至含醇量30％，离心，抽滤，制成药材含量为0.311g·mL^-1的上样液。取预处理(用10倍于树脂重量的95％乙醇冲洗)完毕的HP-20大孔树脂，湿法装柱(径高比1∶10)，柱体积500mL。取上样液800mL(0.5kg药材/L树脂)，用浓盐酸调至pH值为2.0，以0.5BV·h^-1流速上样至完全，依次用2BV的30％乙醇(pH 2.0)、5BV的40％乙醇(pH 2.0)除杂，流速2.5BV/h，采用2BV 15％乙醇，冲洗除酸，流速2.5BV/h，再用5BV 60％乙醇洗脱，流速2.5BV/h，收集洗脱液，减压蒸干(-0.6Bar压力，60℃)得假马齿苋总皂苷提取物141g，经HPLC检测，总皂苷的纯度为55.67％，总皂苷转移率为78.29％。

对照品Bacopaside I(纯度95％)，Chromadex，购自深圳虹彩祥根生物科技有限公司)，Bacoside A₃，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C由实验室自制(纯度95％)：上述制得的假马齿苋总皂苷提取物，首先用硅胶柱分离，以氯仿-甲醇20∶1、10∶1、4∶1、3∶1、1∶1、0∶1梯度洗脱得6个部位，将部位3、4、5合并，得粗品，粗品再用C18硅胶柱分离，甲醇-水1∶9、3∶7依次洗脱，收集洗脱部位2(含有5个皂苷成分)，再经制备型HPLC制备得到(制备柱规格：10×250mm，5μm；色谱条件：205nm，30％甲醇水等度洗脱)。制得的产品是Bacoside A₃，Bacopaside II，Bacopasaponin C isomer及Bacopasaponin C

经MS、¹H-NMR、¹³C-NMR测定，确认其化学结构，具体波谱数据参数如下：

Bacoside A₃