[发明专利]用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物

权利要求书

1.一种Argonaute蛋白与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶。

2.一种Argonaute蛋白编码多核苷酸序列与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中多核苷酸序列是DNA序列或mRNA序列，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。

3.一种Argonaute蛋白表达载体与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中编码HbAgo蛋白的多核苷酸序列有效连接到表达载体中并能在目标细胞中表达，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。

4.如权利要求3所述的HbAgo蛋白表达载体与核酸链的组合物，其中表达载体为原核表达载体或真核表达载体，优选地，表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体，更优选地，表达载体为动物细胞表达载体，更优选地，表达载体为哺乳动物细胞表达载体。

5.如权利要求1-4任一项所述的组合物，其中核酸链是单链或双链核酸链，优选地，核酸链选自单链DNA(ssDNA)，单链RNA(ssRNA)，完全配对或不完全配对的双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)或DNA/RNA杂合链。

6.如权利要求1-5任一项所述的组合物，其中核酸链的长度为15-30个核苷酸或脱氧核苷酸，优选地，核酸链的长度为22-26个核苷酸或脱氧核苷酸。

7.如权利要求1-6任一项所述的组合物，其中核酸链的核碱基、核糖和/或磷氧键被化学修饰，优选地，核碱基的修饰包括杂环修饰、5一甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤，核糖的修饰包括己糖、2’-O-甲基取代核糖、环戊烷、alpha构象核糖，锁核酸(Locked nucleic acid)，磷氧键的修饰包括硫代寡核苷酸和甲基代寡核苷酸、phosphoramidates、SS-ODN和磷酸三酯、硼烷代寡核苷酸。

8.如权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述组合物处于纳米粒子、外泌体和/或微囊泡中。

9.如权利要求1-8任一项所述的组合物，其中所述组合物用注射器或基因枪进行递送。

10.如权利要求1-9任一项所述的组合物，其中Argonaute蛋白对应的NCBI基因序列号选自：AFZ73749.1、WP_012265209.1、WP_006111085.1、WP_006090832.1、WP_006183335.1、WP_002747795.1、WP_012265209.1、WP_011378069.1、WP_006054116.1、WP_058572808.1、WP_006111085.1、WP_049969002.1、WP_049934199.1和GenBanK：ELZ29017.1，优选地，Argonaute蛋白是HbAgo，其是指波多黎各盐几何形菌Halogeometricum borinquense的Argonaute蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

11.如权利要求1-10任一项所述的组合物，其中编码Argonaute蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

12.如权利要求1-11任一项所述的组合物，其中Argonaute蛋白或多核苷酸序列与核酸链的摩尔比为20:1到1:10⁷之间。