[发明专利]视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用

说明书

本发明提供了视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用。具体地，本发明提供了一种无血清的冻存液，所述冻存液含有二甲基亚砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)，和任选的无血清培养基。本发明还提供了本发明冻存液冻存和复苏的人视网膜色素上皮细胞。实验表明，复苏后视网膜色素上皮细胞的活性高达90％以上，接种培养后形态上具有呈典型的六边形铺路石样，蛋白标记物RPE65呈阳性的细胞(即RPE65⁺视网膜色素上皮细胞)的比例高达98％。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用。

背景技术

视网膜退行性病变是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病。其中年龄相关性黄斑变性患者，全球大约有3千万到5千万，而视网膜色素变性患者约1百万。目前我国的年龄相关性黄斑变性患者大约超过2000万人，并预计将在2050年增加一倍。

由于视网膜退行性病变主要表现为黄斑区视网膜色素上皮(Retinal PigmentEpithelium,RPE)的损伤，因此再生医学RPE细胞的替代移植治疗成为治疗研究的主要方向。迄今已报道了多种来源的RPE细胞移植，主要有患者自体RPE细胞移植、虹膜色素上皮细胞(Iris Pigment Epithelium,IPE)移植，胚胎和成人RPE细胞移植，以及胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)来源的RPE细胞移植。这些细胞移植在动物实验中均显示出明确的治疗作用，但是又均存在各自的缺陷。IPE对某些视网膜变性模型具有治疗作用，但是对IPE和RPE的表达谱研究表明IPE缺乏视紫红质循环中的某些关键酶，并不能完全替代RPE的生理功能。

胚胎干细胞的临床应用存在伦理争议，因潜在致瘤性其安全性也始终令人诟病；iPSCs在构建过程中被导入了潜在的原癌基因，逆转录病毒整合进入宿主基因组也会增加致瘤的风险，最近的研究也证实了iPSCs比胚胎干细胞有更高的畸胎瘤形成倾向。虽然有研究报道减少或完全去除外源性转录因子，或者通过小分子化合物，或者通过导入后再去除的办法来解决问题。但是无论那一种方法对iPSCs进入临床前的安全性还有待进一步验证。

研究表明，人RPE细胞具有免疫原性小，不引起T细胞显著的特异性免疫反应，还可以抑制T细胞激活，避免了免疫抑制剂的使用；具有极大的体外增殖能力，一个人眼球可以用于治疗数百名AMD患者，减轻了对人RPE细胞临床应用的取材限制、经济负担和伦理争论；人RPE细胞在体内可以分泌营养因子，与宿主视网膜形成突触连接；在致肿瘤性风险上明显优于干细胞来源的RPE细胞；能够表达多种RPE特有的功能性标志物等优点，是视网膜色素上皮细胞移植替代治疗最有希望的细胞来源之一。

人视网膜色素上皮细胞的增殖能力巨大，临床应用前景巨大，因此对细胞制剂有长期保存和便于临床注射使用的要求。以往视网膜色素上皮细胞的冻存都是在添加动物血清(主要为FBS)的培养体系下进行的。一方面，由于动物血清具有异种蛋白免疫排斥的风险，且动物血清中的成分不明确，可能含有动物来源的病原体，易被病毒、支原体、疯牛病病毒感染，在生产临床级别的人用细胞制剂时，理论上会导致一些病原体的传播，因此在临床应用中具有潜在的危险。另一方面，血清间具有批次差异，造成不同批次冻存的细胞表型、增殖能力、长期培养后的细胞功能等存在较大差异，直接影响了视网膜色素上皮细胞的临床应用。因此，如果想让人视网膜色素上皮细胞进行大规模生产并广泛应用于临床，必须有无动物源性成分的体外培养方法。而目前市场上的临床级别冻存液(不含动物源性成分)成分复杂，成本昂贵，而且复苏效率较低，并不适合临床上大规模生产。

综上所述，本领域迫切需要开发一种适用于视网膜色素上皮细胞的无动物血清(如胎牛血清)且复苏效率高的冻存液。

发明内容

本发明的目的就是提供一种适用于视网膜色素上皮细胞的无动物血清、复苏效率高的冻存液及其制法和用途。