[发明专利]大丽轮枝菌VdKu80基因敲除突变体菌株，其构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一株敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株、其构建方法及其应用，并评估了该突变体菌株在大丽轮枝菌基因功能研究中的适用性。本发明构建VdKu80基因敲除载体片段，通过PEG介导的原生质体遗传转化，从转化子中筛选并鉴定得到单拷贝敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株VdXS11‑△VdKu80。本发明的敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株在生长速率、菌落形态、压力响应、分生孢子产量、微菌核形成和致病性表型与野生型菌株无显著差异。使用本发明的突变体菌株作为受体菌株进行基因敲除，其基因敲除率比野生型菌株提高了20％以上，因此能够作为受体菌株对大丽轮枝菌其他基因进行敲除实验。

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌突变体菌株及其应用，特别涉及敲除VdKu80基因的大丽轮枝菌突变体菌株，还涉及以所述大丽轮枝菌突变体菌株为受体菌株进行基因定点敲除的应用，属于真菌分子生物学领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是一种重要的植物病原真菌，属于子囊菌门、粪壳菌科、轮枝菌属。它在全世界范围内有200种以上的寄主，包括乔木、灌木、经济作物和观赏性花卉等。由其引起的病害会导致植物枯萎死亡，因此造成了巨大的经济损失。另外，大丽轮枝菌也是导致北京香山黄栌枯萎病的病原真菌，每年造成大量的黄栌枯萎死亡，严重的影响了香山红叶的生态价值和景观价值。对于由大丽轮枝菌引起的枯萎病，目前主要防治措施包括a.物理方法：加强营林措施、施肥灌溉增强树势、及时清理病害木残体防止发生再次侵染；b.化学方法：使用各种农药灌根、直接注射至受害植物以及使用化学农药熏蒸处理土壤；c.生物方法：筛选对大丽轮枝菌具有拮抗作用的真菌(木霉)和细菌(枯草芽孢杆菌)、选育抗病植物。但是目前使用的这些方法防治效果并不理想。导致其难以防治主要有两个原因：1、大丽轮枝菌主要危害寄主的维管束，一般的化学农药以及拮抗菌无法发挥功能，因此效果大打折扣；2、大丽轮枝菌在其病害循环的后期会形成黑色素化的休眠结构“微菌核”，该结构由膨胀分隔的菌丝聚集而成，对于不良的外界环境具有极强的抗逆性，并且能够在土壤内存活数年以上，一旦遇到合适的寄主，微菌核就会萌发形成菌丝，作为初侵染源，继续对植物进行危害。

随着科学技术的发展，人们开始大量研究大丽轮枝菌致病的分子机制以及大丽轮枝菌微菌核形成的分子机制，从而为大丽轮枝菌的防治提供理论依据。这方面的工作在农业有害病原真菌稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)中取到了较大进展，大量参与附着胞形成及侵染过程的相关基因功能被研究，明确了它们在稻瘟菌侵染及致病的过程中发挥的功能并解析了它们之间的调控网络，为稻瘟菌的防治提供了巨大的价值。因此，通过基因功能研究揭示大丽轮枝菌致病分子机制和微菌核形成分子机制，对于病害的防治意义重大。

对于大丽轮枝菌的基因功能研究，近十年来取得到了巨大的进展，尤其是在大丽轮枝菌全基因序列公布之后。大丽轮枝菌共有10535个编码基因，而且随着研究的进一步深入，为了更好的解析大丽轮枝菌的致病及微菌核形成的分子机制，开展高通量的基因功能研究是十分必要的。但是目前国内外已经研究功能的基因数量还非常有限，造成这一现象的一个重要原因是其同源重组率低，导致基因敲除效率不高。虽然近年来，研究者通过改变载体构建方法从double joint PCR到Split-marker、改变转化方法从PEG介导的原生质体转化到农杆菌介导的转化等都有效的提高了基因敲除效率，但是目前基因敲除效率依然是限制大丽轮枝菌基因功能研究的主要因素之一。因此，提高大丽轮枝菌基因敲除效率对加快大丽轮枝菌基因功能研究的进程具有重要的意义。