[发明专利]一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的质粒载体及方法

权利要求书

1.一种用于得到对盐胁迫高敏感的植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：质粒载体导入到植物细胞中，筛选携带有所述质粒载体的植物细胞，并将其培育成植株，即得到对盐胁迫高敏感的植物,所述质粒载体包含MdMAX1基因表达框和筛选标记，所述MdMAX1基因表达框由包含在植物中组成型表达的强启动子和由所述强启动子控制表达的MdMAX1基因，所述MdMAX1基因表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，所述MdMAX1基因的序列如SEQ ID NO:2所示，所述质粒载体由所述MdMAX1基因顺着CaMV35S启动子的转录方向插入到pCAMBIA1300质粒的BamHⅠ和PsTⅠ之间得到。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物是拟南芥、苹果或烟草。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；

2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404制作为侵染液；

3）用所述侵染液侵染拟南芥花序，收集果荚，抗性筛选后，PCR 检测得到阳性转基因植株，经过连续多代筛选得到纯合体，收取种子，培养，得到对盐胁迫高敏感的拟南芥。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1） 将获得的拟南芥种子，分别用70%酒精消毒3min，4%次氯酸钠消毒8-10min，灭菌水冲洗5次，吸干水，播种于种子萌发培养基上，光培养，至小苗长出，移栽到基质培养到开花；

2） 选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用稀释液悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；

3）将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50 mg • L-1 Hyg 抗性筛选后，PCR检测得到阳性转基因植株，经过连续 3 代筛选得到 T3 代纯合体，收取种子，培养，得到对盐胁迫高敏感的拟南芥。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用所述质粒载体转化农杆菌LBA4404，得到携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404；

2）用所述携带有所述质粒载体的农杆菌LBA4404转化为侵染液；

3) 用所述侵染液侵染烟草的幼嫩组织，分化培养得到初代芽体后切下进行继代培养，生根培养，得到对盐胁迫高敏感的烟草。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）播种：将获得的烟草种子，分别用70%酒精消毒1min，0.7%次氯酸钠消毒23-25min，灭菌水冲洗3次，吸干水，播种于种子萌发培养基上，光培养；

2）预培养：剪下幼嫩叶片，切成方形,叶片向光面向上摆放于预培养培养基上，倒置培养1d；

3）选取农杆菌LBA4404单克隆菌落接种于10mL YEP液体培养基中，28℃、200 rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8；取其中lmL菌液加入20mL YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD600为 0.6-0.8，离心收集菌体，用MS液体培养基悬浮稀释20倍，得到侵染液，备用；

4）将经预培养的烟草叶片浸入菌液10 min，期间多次摇晃；然后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干多余菌液，转移至共培养基上，封口，28℃暗培养1 d，之后，移至分化培养基上培养，每隔15 d更换一次培养基；

5）待芽长至2cm时，切下，部分继续继代培养，部分移入MS生根培养基上进行生根，根系发育好后，炼苗后移入盛有基质的营养钵中，温室常规管理，得到对盐胁迫高敏感的烟草。