[发明专利]一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法

说明书

一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法，涉及污水生物处理领域。选取脱氮型污泥，用1*PBS清洗，稀释至原本泥量；脱氮型无膨胀污泥：样品涂在玻片well孔中，室温晾干。避光条件下，取DAF‑FM DA添加到涂有样品的well孔中，20‑37℃恒温静置5‑20分钟后取出，避光条件下1*PBS洗玻片，晾干，加入抗荧光衰减剂并指甲油密封，荧光原位检测；脱氮型膨胀活性污泥：避光条件下，将DAF‑FM DA与样品等量混合，0‑4℃下静置5‑20分钟。样品平铺在玻片well孔中，室温晾干，加入抗荧光衰减剂并密封，荧光原位检测。本发明，可用来确定NO变化情况及NO在不同微生物细胞中的分布情况。

技术领域

本发明涉及污水生物处理领域，提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法。

背景技术

生物脱氮过程包括硝化过程和反硝化过程，在生物反硝化过程中会产生NO中间产物。NO对微生物作用存在不同论断，一方面NO是无色无味且难溶于水的有毒气体，对微生物会有一定的毒害作用；但另一方面NO是真核生物体内重要的活性分子，在微生物体内也发挥着重要作用，例如在过氧化氢压力下保护微生物细胞、提高微生物耐药性等。关于脱氮微生物胞内NO对微生物作用的研究可能为脱氮型活性污泥的生理特性提供新的思路，因此对脱氮型微生物胞内NO的研究具有重要意义。

然而目前对NO的检测技术还存在不足之处，尤其是对脱氮型活性污泥中不同种类微生物NO产生情况及对反硝化作用影响的技术相对缺乏，开发一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法来研究脱氮型活性污泥微生物在反硝化过程中的作用及不同种类微生物在此过程中的NO贡献情况十分必要。

发明内容

针对上述现象不足之处，本发明提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法，该方法可以对所有脱氮型污泥进行微生物胞内NO的原位测定，以此来确定反硝化过程中NO变化情况及NO在不同微生物细胞中的分布情况，本方法为分析各菌群对反硝化功能分析提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的优化方案。

一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、选取未膨胀的脱氮型污泥或已膨胀的脱氮型污泥作为目标污泥，分析其特征情况；

(2)、用1*PBS清洗目标泥三次，并用1*PBS稀释至原本泥量，去除脱氮型污泥中其他杂质的干扰；

(3)、未膨胀的脱氮型污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：吸取步骤(2)1-10μL样品均匀地涂在事先用明胶包被好的玻片上的每个well孔中，涂片量同样以刚好平铺实际玻片上well孔为准，并在室温下晾干；在避光条件下，取1-20μL浓度为1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO荧光探针)添加到涂有样品的每个well孔中，DAF-FM DA添加量以探针液包被住well孔中污泥；将样品放置于20-37℃恒温条件下静置5-20分钟后取出，在避光条件下用1*PBS洗涤玻片三次，将未进入微生物细胞的DAF-FM DA(NO荧光探针)液去除，并置于室温下晾干，加入抗荧光衰减剂，并用指甲油密封，进行后续荧光原位检测；

或已膨胀的脱氮型污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：在避光条件下，先将稀释好的1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO荧光探针)与步骤(2)样品等体积混合，混匀后置于0-4℃条件下静置5-20分钟，后再吸取1-10μL加有DAF-FM DA的样品均匀平铺涂在事先用明胶包被好的玻片每个well孔中(涂片量以刚好平铺实际玻片上well孔为准)，并置于室温下晾干，加入抗荧光衰减剂，并用指甲油密封，进行后续荧光原位检测。

未膨胀的脱氮型污泥的SVI值小于150mL/g，已膨胀的脱氮型污泥的S VI值大于150mL/g。

DAF-FM DA的溶液优选为1*PBS。