[发明专利]一种用于检测禽白血病病毒J亚群的试剂盒

说明书

本发明提供了用于检测禽白血病病毒J亚群(ALV‑J)的试剂盒，属于RT‑PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有一对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明还提供了检测禽白血病病毒J亚群的方法。本发明试剂盒和检测方法具有高特异性、高灵敏度、高效率、通用性好、低成本的特点，可在6.5h内对临床病料进行快速鉴别诊断，本发明为ALV‑J的早期快速诊断和开展分子流行病学调查提供技术手段，以更好地指导养禽生产中对该病的防控。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于检测禽白血病病毒J亚群的试剂盒及其应用。

背景技术

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Loueosis virus，ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类肿瘤性疾病的总称。根据宿主范围、病毒囊膜抗原差异、病毒干扰试验和基因组分子生物学特性，将ALV分为A～J 10个亚群。J亚群禽白血病毒(Avian Leukosis Viruss Subgroup J，ALV-J)是1991年首次从肉鸡中分离得到的一种新型禽白血病毒，其原型株为HPRSl03。ALV-J主要引起肉鸡发生髓细胞瘤变(ML)以及其它各种恶性肿瘤。基本所有类型的鸡对ALV-J都易感。近年来我国主要以ALV-J感染为主，占ALV感染鸡群的65-70％，且本病可垂直传播，给养禽业造成巨大危害。

根据病毒血清中和试验、在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、与相同或不同亚群成员的干扰模式、囊膜糖蛋白的特性以及基因组的分子生物学特性等，将禽白血病/肉瘤病毒划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚群。自然感染鸡群的只有A、B、C、D、E和J六个亚群。这六个亚群中，相对来说，J亚群与其它亚群间的抗原性差异最大，而且外源性J亚群的致病性和传染性最强，内源性ALV-J普遍存在生物体内，无致病性，通常不作为检测目标，一般ALV-J的检测指的是致病力较强的外源性ALV-J。

ALV-J属于转录病毒科、甲型反转录病毒属，病毒粒子呈球形，由外部囊膜和内部电子致密核心组成。编码反转录酶(RT)的pol基因位于核芯，该酶是前病毒DNA整合进宿主基因组所必需的。病毒的囊膜包含env基因编码的2个糖蛋白：表面糖蛋白(SU)gp85和穿膜蛋白(TM)gp37。SU是存在于病毒颗粒表面的棒状结构，决定病毒的亚群特异性，是病毒亚群特异性抗原。囊膜糖蛋白gp85位于病毒粒子表面呈球形结构，通过识别细胞膜上的特异性病毒受体与宿主细胞相互作用，是病毒的亚群特异性抗原，在免疫机能健全的鸡体内能够诱导特异性抗体产生。gp85蛋白参与病毒中和反应，决定病毒的亚群特异性和宿主范围。

传统的ALV-J检测方法为病理组织学检查、病毒分离和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。ALV-J的靶细胞是骨髓细胞，ALV-J感染后形成肉眼可见的骨髓细胞瘤，经HE染色后，瘤细胞形态一致，有丰富的嗜酸性细胞浆。经典的ALV感染产生的是法氏囊肿瘤或淋巴细胞瘤，瘤细胞体积大，胞浆较少，呈嗜碱性染色。通过肿瘤鉴定和病毒学检查初步诊断ALV-J在鸡群中的感染，进一步可以通过病毒分离进行确诊。ALV-J在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长良好，但却不能在哺乳动物细胞培养物中复制或转化。将病鸡的血液、泄殖腔拭子、胚胎或羽髓材料经处理后接种于CEF上培养，ALV-J能在CEF上增殖，但是不产生细胞病变，分离得到的病毒可以与抗ALV-J的抗血清进行中和反应，但是该方法需要在实验室制备抵抗内源性疾病的CEF，不适合进行大批量样本的检测，而且ALV-J基因变快，其抗原性不断发生变化，需要筛选匹配的ALV-J特异性的血清进行中和试验，给检测增加了难度。

随着分子生物技术的飞速发展，RT-PCR被应用于ALV-J的检测中，其敏感性比ELISA高。Smith EJ等通过设计E元件和3’LTR特异性的引物，建立了特异性检测ALV-J前病毒DNA的PCR扩增方法，由于其灵敏性和特异性高，可以替代常规的病毒分离。研究表明，用特异性引物对ALV-J进行RT-PCR扩增不失为一种快速、准确的检测方法，该方法省时省力，不仅能用于养殖场中ALV-J的快速检测，还可以用于生物制品、SPF鸡胚、家禽肉制品等的ALV-J快速检测。