[发明专利]丙酮酸高温高产工程菌株及其应用

说明书

本发明以耐热性马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)为平台，利用基因工程、代谢工程、分子生物学以及合成生物学的方法，构建一株丙酮酸脱羧酶和甘油‑3‑磷酸脱氢酶敲除的菌株，通过代谢调控恢复其生长从而提高丙酮酸的产率和生产速率，然后进一步提高菌株的木糖代谢能力，使其具备利用木糖生产丙酮酸的能力。最终解除工程菌株的葡萄糖效应，从而使工程菌株具备在高温下同时糖化木质纤维素和共利用葡萄糖和木糖并且共发酵生产丙酮酸。本发明获得的马克思克鲁维酵母菌株YZB058可以同时共利用葡萄糖和木糖在较高温度(42℃)下，生产丙酮酸。在42℃条件下，YZB058能够同时共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖在36h生产29.21g/l丙酮酸，其生产速率为0.81g/l/h，总得率为0.48g/g。

技术领域

本发明涉及微生物代谢工程，糖代谢和共利用以及微生物发酵生产丙酮酸的领域。具体地说，本发明提供了能够在较高温度下(42℃)同时共利用葡萄糖和木糖共发酵生产丙酮酸的耐热工程酵母。

背景技术

丙酮酸的合成方法主要包括化学合成法、酶转化法和发酵法。化学合成法通过在液相或气相中将乳酸酯(或酒石酸)氧化为丙酮酸酯，然后水解成丙酮酸，是目前丙酮酸生产的主要方法，已实现了工业化生产。但是化学合成法存在污染严重、成本高等比较明显的缺点(Causey et al.,2004)。

酶法合成丙酮酸由于具有反应混合物组成简单、高底物转化率、产品纯度高、后续分离提取费用低廉和操作简单等优点而成为生物技术法生产丙酮酸研究中的另一个热点。可用于酶法生产丙酮酸的底物有乳酸、酒石酸、富马酸、丙二醇等。酶法虽然具有较高的转化率，但底物成本比较高、来源较窄，限制了其进一步推广应用(Causey et al.,2004；Xuet al.,2008)。

发酵法生产丙酮酸包括直接利用微生物中的一系列酶(如EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)积累丙酮酸的直接发酵法(fermentative method)和利用微生物中某一种特定功能的酶完成由底物向丙酮酸的转化(即微生物先生长，再转化底物为丙酮酸)的休止细胞法(resting cell method)。采用休止细胞法生产丙酮酸的主要优点是可缩短发酵时间。但丙酮酸产量略低于直接发酵法，且操作繁琐，容易染菌，因此不太可能在工业生产中得到应用(Causey et al.,2004；Xu et al.,2008)。

发酵法是生物技术法生产丙酮酸中开展得最早的、也是研究得最多最深入的生产方法。但发酵法生产丙酮酸的问题是转化率比较低，这是因为丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中很容易代谢为其它产物，难以积累。只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的(Causey et al.,2004；Wang et al.,2005)。

比较丙酮酸的各种生产方法可以发现，发酵法生产丙酮酸无疑是扩大丙酮酸应用领域的根本途径。