[发明专利]一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法

说明书

本发明涉及生物防治技术领域，具体公开了一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。本发明直观简便，通过观察有色抑菌圈，克服了传统琼脂平板扩散法用于中药或其它性状相似待测物的体外抗菌试验时由于色深混浊和成分复杂导致难以准确测量抑菌圈直径的弊端。

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法。

背景技术

体外抗菌试验是在体外测定微生物对某种物质的敏感程度的试验，常用于评价抑杀病原菌的活性，已广泛地应用与科研、生产和临床，如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的测定、指导临床用药的药敏试验等。琼脂平板扩散法是目前最常用的方法之一。

传统的琼脂平板扩散法是将指示菌涂布于琼脂表面或均匀混入琼脂中，然后采用纸片法、牛津杯法、打孔法等方法加入待测物，让待测物在琼脂中扩散。由于琼脂无色透明、细菌无色半透明，导致细菌不生长的琼脂区域呈无色透明。若待测物有抗菌活性，其中的细菌等微生物生长受到抑制或杀灭，从而在药物有效浓度的范围内形成微生物不生长的透明圈a1(图1)，在光线较好的环境下辨别测量该透明圈a1的直径用于评价待测物有无抗菌活性及初步评价其活性大小。该透明圈称为抑菌圈，抑菌圈直径大小与抗菌物质浓度和指示菌浓度直接相关。

大量的临床应用研究表明，中药具有不可忽视的抗菌作用。随着临床抗生素应用中出现的耐药细菌问题日趋严重，抗菌中药的研究具有广阔的应用前景。目前中药的体外抗菌活性研究尚无标准化方法，琼脂平板扩散法作为国际通用的抗生素抗菌活性评价方法之一，也被广泛引用到包括中药在内的其他材料的抗菌活性测定中。然而，中药提取液性状特殊，其在琼脂平板中扩散现象不同于抗生素，中药体外抗菌试验不能完全照搬抗生素体外抗菌试验。中药提取液主要特点有：(1)色深混浊：药物扩散后导致琼脂中出现颜色较深及混浊的药物扩散圈，该圈与细菌不生长的透明圈重合，影响抑菌圈直径的测量，难以直观评价抗菌活性大小。如图2所示：琼脂平板上(01)(02)两孔中为色深混浊的黄芩水提液扩散抗菌现象，其中b1为深棕色中药扩散圈(内圈)，b2为浅棕色中药扩散圈(外圈)；(03)(04)两孔为无色澄清的抗生素头孢曲松钠扩散抗菌现象，其中b3为透明抑菌圈，可见：采用传统平板琼脂扩散法进行抗菌试验时，抗生素无色澄清，其药物扩散圈不掩盖透明抑菌圈易于测量，而中药色深混浊掩盖了透明抑菌圈，需仔细甚至无法观察细菌不生长区域导致难以辨别测量抑菌圈；(2)成分复杂：抗生素一般成分单一，其离扩散中心远近不同药物仅浓度不同而成分相同。但中药提取物等往往成分复杂，各成分扩散速度不同，离扩散中心远近位置不同的药物的浓度和成分均有不同，因此细菌不生长圈的大小不仅与药物浓度有关还与药物复杂的成分相关。

综上所述，传统的琼脂平板扩散试验在中药及与其性状相似的色深混浊及成分复杂的待测物的体外抗菌活性评价中尚存在弊端，寻找一种更加直观有效地指示其抗菌活性的体外抗菌方法对于抗菌物质的开发具有重要的应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，可分层显示色深混浊和成分复杂的中药提取物及性状相似的抗菌物质的体外抗菌活性，简便、直观、有效。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种评价抗菌物质体外抗菌活性的试验方法，是将含菌亚甲基蓝琼脂平板用于琼脂平板扩散法的体外抗菌活性试验。

优选地，所述体外抗菌活性试验的具体步骤如下：将待测物溶液加入到新鲜制备的含菌亚甲基蓝琼脂平板上，使其在琼脂中扩散，恒温培养，待指示菌和待测物作用后，观察并测量待测物周围蓝色圈或待测物自身颜色与蓝色的混合有色圈直径作为抑菌圈的直径，并观察抑菌圈颜色深浅，评价待测物体外抗菌活性。