[发明专利]一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体

说明书

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，尤其涉及一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体。

背景技术

杆状病毒是特异感染节肢动物的DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)是杆状病毒的一个模式种。自从1983年Smith等首次把杆状病毒改造成为表达系统以来，由于该系统具有低成本、高产量等优点，而且表达的蛋白构象接近天然真核蛋白，杆状病毒表达系统在科研和生产中被广泛应用。

杆状病毒表达系统是一种暂态表达系统，病毒感染昆虫细胞3-4天后会引起细胞的凋亡和死亡。基于晚期启动子的杆状病毒表达系统的表达时限是从感染后22-24小时开始至宿主细胞死亡。如果能推迟感染细胞的死亡时间，势必能增加外源蛋白的产量。

细胞凋亡是宿主抵御病毒侵染的策略之一，其中细胞调控caspase活性对细胞凋亡非常重要。而草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中目前研究最多的caspase是执行caspase即Sf-caspase-1。2007年，台湾的一个课题组用RNA干扰载体在Sf9细胞中表达Sf-caspase-1的dsRNA，成功沉默了细胞中的Sf-caspase-1，并筛选出抑制Sf9细胞凋亡的细胞系(Lin C C,Hsu J T A,Huang K L,et al.Sf‐Caspase‐1‐repressed stable cells:resistance to apoptosis and augmentation of recombinant protein production[J].Biotechnology and applied biochemistry,2007,48(1):11-19.)。

因为凋亡是生物体清理衰退细胞的积极途径。如果昆虫细胞系自身的抗凋亡途径被阻断，势必会使细胞系退化。目前的抗凋亡细胞系的抗凋亡效果不具有明显的剂量效应，抗凋亡细胞系产量提高率不到2倍。目前的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞病变速度和程度不能降低，蛋白表达水平不能显著提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，旨在解决背景技术提及的问题。

本发明是这样实现的，一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体，该抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体含有一段特定的DNA序列，该DNA序列为SEQ ID NO：1。

进一步，该DNA序列包括U6启动子、与caspase-1同源的21nt核酸序列、9nt loop序列、与21nt核酸序列对应的21nt反义序列、作为转录终止信号的T(n)序列；

所述与caspase-1同源的21nt核酸序列为SEQ ID NO：2；

所述9nt loop序列为SEQ ID NO：3；

所述与21nt核酸序列对应的21nt反义序列为SEQ ID NO：4；

所述作为转录终止信号的T(n)序列为SEQ ID NO：5。

进一步，所述U6启动子作为siRNA表达的调控序列，该U6启动子序列为SEQ ID NO：6。

本发明另一目的在于提供一种抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体的构建方法法为：将靶向Caspase-1小RNA的编码序列直接插入到杆状病毒基因组中；具体包括：

1)、扩增U6启动子并克隆至载体质粒上；

2)、设计靶向caspase-1的shRNA序列，用长引物拼接的方法获得shRNA片段；

3)、将shRNA片段克隆到U6启动子下游；

4)、用PCR方法扩增带U6-shRNA序列的反筛片段；

5)、将反筛片段与AcMNPV Bacmid共转化到含pRed/ET的大肠杆菌HS996菌株，筛选获得抗凋亡的Bacmid。

本发明另一目的在于提供一种上述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体制备的蛋白制品。

本发明另一目的在于提供一种上述的抗宿主凋亡的重组杆状病毒载体制备的疫苗。

本发明获得的抗凋亡Bacmid，可作为病毒载体，用于构建表达外源基因的重组杆状病毒。因为病毒载体上携带抑制昆虫细胞凋亡的干扰RNA序列，所获得的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞病变速度和程度降低，蛋白表达水平显著提高。经测试，以萤光素酶作为报告基因，本发明的抗凋亡载体比改造之前的载体萤光素酶活性提高了10倍(见图3)。本发明获得的杆状病毒载体可用于基础研究，也可用于大规模蛋白药物和疫苗的工业化生产。