[发明专利]一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法

权利要求书

1.一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：斑马鱼胚胎的制备；

步骤二：dCas9-Eve融合蛋白的表达载体构建，将编码dCas9的cDNA序列与编码Eve的cDNA序列重组时，在二者之间置入一个linker序列，所述Eve的DNA序列如SEQ ID No.1所示；

步骤三：进行sgRNA、dCas9-Eve、Cas9和znfl1s基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9-Eve、Cas9mRNA和znfl1s基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；

步骤四：sgRNA的活性鉴定，将sgRNA和Cas9mRNA同时注射入1-细胞期斑马鱼胚胎，待胚胎发育至24hpf，收集5个胚胎，用金属镊子撕去壳膜，放入PCR管中，运用斑马鱼基因型鉴定试剂盒快速提取基因组DNA，再用可扩增出含sgRNA识别序列的基因启动子正向引物和反向引物为扩增引物、以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，之后验证PCR产物大小是否与目的片段一致，并将PCR产物进行测序，判定sgRNA是否具有活性；

步骤五：dCas9-Eve法敲降znfl1s的表达，将鉴定有活性的sgRNA以终浓度50ng/μl和250ng/μl dCas9-Eve进行混合，然后显微注射入1-细胞期的斑马鱼胚胎，待胚胎发育至8hpf，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。

2.根据权利要求1所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎的制备方法包括以下步骤：将斑马鱼饲养于循环水系统中，房间温度28.5℃，每天固定光照14小时，黑暗10小时，上、下午各喂食一次，收集胚胎时，提前一天将交配用的雌鱼和雄鱼分别置于交配盒的两端，中间以隔板隔开，待第二天早上光照时，将隔板抽出，雌雄交配，收集胚胎，并将胚胎置于28.5℃的恒温培养箱中培养备用。

3.根据权利要求1所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述步骤三中纯化包括如下步骤：首先向Buffer RPE加入无核酸酶无水乙醇，然后往体外转录的mRNA样本中加入DEPC处理过的超纯水，使得体积扩大至100μl，加入350μl的RLT，混匀，再将混合液加入到RNeasy Mini制备管中，将制备管放入收集管中，离心并丢掉滤液，加入Buffer RPE，离心并丢掉滤液，再次加入Buffer RPE，离心并丢掉滤液，再次离心后，将制备管放入无核酸酶的EP管内，向制备管中央滴加DEPC处理过的超纯水，离心，最后用紫外分光光度计测定mRNA浓度，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定mRNA质量后，分装并保存于-80℃。

4.根据权利要求1所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述步骤五中胚胎整体原位杂交法的具体操作步骤为将胚胎用4％多聚甲醛固定，4℃过夜，第二天撕去壳膜后，进行梯度脱水，脱水后的胚胎置于-20℃1小时，再进行梯度复水，复水后的胚胎加入预杂交液，于65℃杂交炉中放置5分钟，之后用加入酵母RNA和肝素以及RNA探针的杂交液65℃过夜，第三天，于65℃，依次用含50％甲酰胺、10％20×SSC和0.1％Tween的溶液，2×SSCT，0.2×SSCT清洗，再用pH7.5的MABT室温清洗，之后用封闭液室温封闭1小时后换入含有1/2000-1/5000稀释的地高辛抗体的封闭液，4℃过夜，第四天，用MABT室温清洗之后显色，并先加入平衡液，室温放置10分钟之后，吸出平衡液，换入显色液，避光，室温放置6-8小时，显色完全后，依次用PBST和无水乙醇清洗，加入包埋液，原位杂交结果用莱卡MZ16F立体显微镜拍照记录，对图像进行对比度和光强度处理。

5.根据权利要求4所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述预杂交液为50％去离子甲酰胺、25％20×SSC和0.1％Tween的混合液。

6.根据权利要求4所述的一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，所述封闭液为2％Blocking regent、10％绵羊血清、 70％MAB和0.1％Tween的混合液。