[发明专利]烟草GCN2启动子、其表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种烟草GCN2启动子、其表达载体及其应用。

背景技术

21世纪以来，农作物的生长发育面临着诸多问题。首先，由于化肥的过量使用及工业废水的乱排放导致耕作土壤的板结、盐碱化及重金属过量；其次，由于除草剂过量使用及生物入侵，作物也不得不面对新的超级杂草；最后，由于大气环境污染及温室气体的排放，近些年厄尔尼诺现象日趋频繁，局部地区的干旱及内涝现象越来越多。因此，如何使作物在如此新的复杂的生存环境下生长发育变成了近些年研究的热点。在这种背景下，除了常规技术手段外，更多的研究人员将目光聚焦于参与调节应答各种胁迫的基因上。而启动子作为基因表达的“开关”，是调节基因表达的重要组成部分，也受到越来越多科学家的关注。

GCN2 (general control non-derepressible 2)作为eIF2的激酶，通过磷酸化eIF2的α亚基，来应答各种生物和非生物胁迫。在动物中存在四种eIF2α 激酶（PKR、PERK、HRI和GCN2）来分别应答不同的胁迫。在植物中，GCN2是由单个基因编码的，并且是唯一的eIF2α激酶。另外，序列分析表明高等植物中只存在一个GCN2类似的eIF2α激酶(Zhang等，2003；Lageix等，2008；Zhang等，2008；Hey等，2010) 这表明植物与动物不同，植物中仅存在一种eIF2α激酶，它在植物的生长发育中起到重要作用。

目前研究发现植物中的GCN2能被多种植物信号物质激活，如MMS(甲磺酸甲酯)、MeJA（甲基茉莉酸酯）、ACC(1-氨基环丙烷-1羧酸)或SA（水杨酸）等处理植物后，并且磷酸化真核翻译起始因子eIF2α(Lageix等，2008；Zhang等，2008)；并且很多植物激素在植物免疫反应中起着重要作用的信号分子，尤其是水杨酸（SA）更是被称之为植物抗病激素。此外，研究发现植物中GCN2介导的eIF2α磷酸化可以被UV辐射、冷胁迫、嘌呤缺乏和损伤等胁迫所激活(Lageix等，2008；Zhang等，2008)，这说明GCN2对植物激素响应与应答胁迫之间有着密切关系。

启动子是提供RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列和相关的调控元件，通常位于基因的上游，驱动基因转录，是调控基因表达的手段。而烟草GCN2启动子，在其基因序列上不仅有TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(initiator)等核心元件，还发现了MeJA、ERE等应答元件。由于烟草是重要的模式植物及经济作物， 因此，烟草GCN2启动子的分离和鉴定对于烟草应答各种逆境胁迫研究以及烟草作为生物反应器表达外源基因具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以启动GCN2基因的表达，其序列中存在的植物激素等响应元件可以用来调控GCN2基因表达的烟草GCN2启动子。

为达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种烟草GCN2启动子，其核苷酸序列为：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

（2）与（1）限定的核苷酸序列中至少具有90%同源性的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体的启动子是核苷酸序列为SEQ ID NO.1的启动子，可以是外源目的基因在烟草中表达。

上述烟草GCN2启动子可在启动目的基因表达中的应用，所述目的基因优选为GUS 基因。

上述烟草GCN2启动子启动GUS 基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）将上述烟草GCN2启动子插入pCAMBIA-NPT-GUS载体的中并且替换该载体中已有的35S启动子，得到重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入出发植物并进行培育，在所述出发植物中由所述GCN2启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草，更优选为烟草K326。

本发明进一步提供了一种在植物中表达外源基因的方法，采用上述重组表达载体，将外源目的基因导入该载体，转化植物，获得的转化植物可以表达外源基因。

本发明启动子可以驱动目的基因在植物中表达，能够作为生物反应器的技术支撑。此外，本发明提供的启动子序列上包含多个激素和胁迫响应位点，有助于促进人们对烟草应答胁迫机理的研究，本发明在农业和医学领域具有广阔的应用空间和市场前景。

本发明具有以下积极有益的技术效果：