[发明专利]一种加强型Slit2 CAR-T和CAR-NK细胞制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种加强型Slit2CAR‑T和CAT‑NK细胞制备方法和应用，所述加强型CAR‑T和CAT‑NK细胞分别为包含加强型CAR嵌合抗原受体的T细胞和NK细胞，其中加强型CAR嵌合抗原受体包括能够结合抗原的胞外结构域、跨膜结构域、胞内免疫共刺激分子、内部核糖体进入位点IRES和HAC‑HSA串联；其中胞外结构域包括Slit2蛋白的D2结构域。本发明的加强型CAR‑T细胞、加强型CAR‑NK细胞，可封闭PDL‑1抑制性信号，增强CAR‑免疫细胞杀伤活性，并激活肿瘤浸润的免疫细胞；加强型CAR‑免疫细胞可作为细胞药物用于肿瘤类疾病的治疗，使改造后的免疫细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤，且具备更高效的肿瘤杀伤活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种针对抗肿瘤干细胞的嵌合抗原受体细胞，特别是加强型CAR-T细胞和加强型CAR-NK细胞。

背景技术

PD-L1全称程序性死亡受体-配体1，英文名字programmed cell death-Ligand 1，是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白。PD-1全称程序性死亡受体1，英文名字为programmeddeath 1，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。PD-1(programmed death-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)等。PD1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。

在2016AACR年会上，华盛顿大学医学院皮肤病学科教授Paul T.Nghiem，MD，PhD做出报道，pembrolizumab这一具有抗PD-1作用的单克隆抗体可诱导高级别默克尔细胞癌的高反应性，中位无进展生存期PFS是9个月，传统化疗的患者PFS是3个月。近日百时美PD-1抑制剂Opdivo在临床试验方面取得新进展，发布了两组数据，其中一组显示，对当前任何药物均无治疗反应的晚期黑色素瘤的患者在使用Opdivo治疗中取得了34％五年生存率的结果。值得注意的是，IV期黑色素瘤患者的五年生存率通常只有15％到20％。另一组数据表明Opdivo和Yervoy联用治疗晚期黑色素瘤患者中取得22％的总缓解率，并且达到了69％两年总体生存率。另一项研究表明难治复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者在使用Opdivo治疗后生存期和存活率大大提高。数据表明，与对照组相比Opdivo治疗组死亡风险显着降低30％，中位总生存期显着延长。Opdivo治疗组一年存活率为36％，对照组为16.6％。此外，该研究还通过口咽部肿瘤HPV状态及PD-L1表达状态评估了Opdivo相对于对照方案的疗效。近期，Keytruda获FDA治疗复发性或难治性(R/R)经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)的突破性药物资格。

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。该疗法是一种出现了很多年但近几年才被改良使用到临床中的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CAR)T细胞(CAR-T)是对病人自己的T细胞经过基因修饰而构建出的，在治疗血癌上取得成功，但是利用CAR-T治疗实体瘤(是由异质的细胞群体组成的，这些异质的细胞具有不同的表面分子)并未取得理想的治疗效果。

CN105505869A公开了一种针对肿瘤干细胞的嵌合受体T细胞，此T细胞嵌合了2～3个独立的抗原受体，每个嵌合的抗原受体分别由不同的肿瘤干细胞特异性标记物的抗体的抗原结合部与不同的功能蛋白结合组成。此嵌合受体T细胞仅能在2-3个嵌合抗原受体均识别抗原后，才激活T细胞抗肿瘤作用，此方法在一定程度上提高了特异性但对于隐藏抗原的肿瘤细胞的特异性较低。