[发明专利]一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明是涉及一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

实时聚合酶链式反应(Real-time PCR，简称实时PCR)是指扩增与检测同步进行，通过检测扩增循环中荧光信号的变化以指示核酸扩增过程。实时PCR核酸检测技术早期使用荧光染料，例如SYBR GREEN，EVE GREEN，指示PCR反应产物。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特扩增，虽然增加熔解曲线检测一步，但在实际应用中还是受到了很大限制。随后，实时PCR核酸检测技术中开始应用标记荧光基团的核酸片段作为指示探针，例如5’-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。实时PCR中加入探针对PCR扩增产物具有第二识别作用，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠，也无需熔解曲线检测一步。但目前的荧光探针检测技术仍然存在一些缺陷，例如：探针结合的效率不高，造成检测灵敏度低，荧光信号强度低；探针的荧光激发和淬灭基团量不成比例，或因结构问题而不能足够靠近，造成检测系统荧光本底背景高；探针的结构和检测原理复杂，不易设计，且对目标核酸序列的GC含量、二级结构等较为挑剔，普适性差等。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种检测灵敏度高、荧光信号强度高、荧光本底背景低、设计简单、普适性好的可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种可对核酸扩增产物高灵敏检测的荧光探针，所述荧光探针为一条寡核苷酸链，其5’端标记有荧光激发基团，3’端标记有荧光淬灭基团，其特征在于：在5’端与3’端之间包含两段分别与目标核酸序列正向链和反向链反向互补的寡核苷酸序列，且在靠近5’末端有2～5个碱基与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基，同时在两端反向互补的序列交界区域也有2～5个碱基与目标核酸序列特异性结合但在所述荧光探针上无反向互补碱基。

作为优选方案，所述寡核苷酸链的总长为40～60碱基。

作为优选方案，所述的荧光激发基团为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，所述的荧光淬灭基团为TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

作为优选方案，每段寡核苷酸序列的长度为19～25碱基。

由于本发明所述的荧光探针在PCR扩增反应混合液中，在一定条件下可形成自互补结合的、上下各有2～5碱基凸出的分子内的双链发卡结构，该结构形成后，荧光激发基团和荧光淬灭基团非常接近，会发生荧光能量转移效应，从而不会有荧光信号释放；当有目标核酸序列存在时，该荧光探针变性展开，其自身的两段寡核苷酸序列分别与目标核酸序列反向互补结合，使荧光激发基团远离荧光淬灭基团，从而释放荧光信号，并且信号的强度与模版浓度成正比。因此，本发明所述的荧光探针可用于实时荧光定量PCR中的目标核酸序列(如：微生物特异序列、融合基因序列、mRNA序列等)的检测。

另外，由于常规的PCR扩增反应包括三个主要步骤：变性、退火和延伸，而在变性阶段，本发明所述的荧光探针由于高温解链，荧光激发基团和荧光淬灭基团会相互分离释放荧光，而在退火阶段，如果反应混合液中不存在目标核酸序列，则本发明所述的荧光探针会恢复发卡状的二级结构，释放的荧光会被淬灭，如果存在目标核酸序列，则本发明所述的荧光探针会处于解链状态下，会与其退火结合形成更为稳定的二级结构，从而释放出荧光；而在延伸阶段，本发明所述的荧光探针会从目标核酸链上被置换下来。因此，随着PCR扩增反应的进行，循环数的增加，产物量逐渐增多，可通过在每个循环退火阶段收集相应荧光通道的荧光信号，根据强度间接判断扩增产物量的多少，以及可用于检测实时荧光定量PCR中的单碱基变异(如：SNP分型、基因点突变、碱基缺失、碱基插入等)情况。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：