[发明专利]一种生产2-酮基-L-古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌

说明书

本发明公开了一种生产2‑酮基‑L‑古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，属于代谢工程领域。本发明采用分子生物学手段引入sdh、sndh，并通过SH3lig和SH3支架结构使SDH和SNDH空间位置上接近并调节两酶比例，从而实现山梨醇通过氧化葡萄糖酸杆菌生产2‑KLG，简化了2‑KLG生产工艺，摇瓶水平2‑KLG产量最高可达45.39g·L^‑1，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种生产2-酮基-L-古龙酸的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，属于代谢工程领域。

背景技术

2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)是维生素C的重要前体。目前国内应用较多的2-KLG生产方法为二步发酵法：第一步，底物D-山梨醇经氧化葡萄糖酸杆菌转化为L-山梨糖；第二步，L-山梨糖经由生酮基古龙酸菌(俗称小菌)和巨大芽孢杆菌(俗称大菌)构成的混菌体系转化为2-KLG。在第二步混菌发酵产酸的过程中，负责糖酸转化的微生物只有小菌，其单独培养时生长微弱，几乎不产酸；大菌为伴生菌，虽不直接参与L-山梨糖向2-KLG转化过程中的相关酶催化反应过程，但能在混菌体系中显著促进小菌的生长和2-KLG的积累。混菌发酵增加了生产工艺的复杂性，在实际生产过程中，无法对混菌体系中的两菌比例进行快速检测，而这一比例又对2-KLG生产影响显著；巨大芽孢杆菌广泛存在于土壤中，对多种噬菌体较为敏感，由于噬菌体问题导致的倒罐是2-KLG生产过程中一个难以忽视的问题；小菌又存在产酸性状不稳定的缺点。传统二步发酵法生产2-KLG的过程需三种细菌参与，发酵过程分为两步需要二次灭菌，不仅延长了生产周期还造成了能源和人力财力的大量浪费。因此，将小菌中涉及2-KLG代谢的关键基因克隆到G.oxydans中，得到产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。

通过在关键酶上构建SH3lig支架结构，使关键酶在空间位置上接近，并调节关键酶在G.oxydans的比例从而提高2-KLG的产量，国内未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产2-KLG的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌。

所述基因工程菌表达了来自Ketogulonicigenium vulgareWSH-001的编码山梨糖脱氢酶的基因sdh、编码山梨酮脱氢酶的基因sndh；其中，所述sdh基因3’端通过限制性酶切位点连入序列如SEQ ID NO.1所示的(GS₂-SH3lig)₂得到sdh-(GS₂-SH3lig)₂，所述sndh基因5’端通过融合PCR连入SH3-GS₂得到SH3-GS₂-sndh。所述sdh-(GS₂-SH3lig)₂前启动子为中强度P_tuf启动子，SH3-GS₂-sndh前启动子为强启动子P_dnak启动子。所述P_tuf、P_dnak、sdh-(GS₂-SH3lig)₂及SH3-GS₂-sndh基因连入G.oxydans-E.coli穿梭质粒载体pBBR1MCS-2，然后转入宿主G.oxydans WSH-003。

所述基因sdh在NCBI中登陆号为AEM40042.1、基因sndh在NCBI中登陆号为AEM39934.1。

所述基因工程菌的构建过程包括以下步骤：

1)根据sdh、sndh基因序列设计引物克隆sdh、sndh基因；