[发明专利]用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体提供一种用于高通量测序的基于固相载体膜富集目标核酸的方法。

背景技术

随着高通量测序的发展，基因组测序成为了高通量、高深度鉴定相关位点变异，进而识别潜在疾病的最主要手段，同时在科研上具有广泛的应用。在医学诊断上，高通量测序可直接获得大量相关位点变异信息，对于精准医疗具有重大意义。但是，基于目前的状况，多数研究目标和诊断目标只占总体样本的一小部分，例如绝大多数已知的疾病相关位点变异存在于基因组某一特定区域，如外显子组，约占人基因组全长的1％-2％左右；线粒体DNA，占人全基因组的比例更低，仅有0.03％左右；由乙肝病毒整合所诱发的肝癌患者中，整合于人基因组上的乙肝病毒DNA占全基因组的比例极低，约占全基因组的0.0001％-0.0005％。虽然人全基因组测序可以实现外显子组与线粒体DNA以及整合于人基因组上的乙肝病毒DNA的覆盖，但要达到数据分析所要求的数据量则花费成本较高，个体化选择富集位点困难，导致在临床与科研上开展广泛的应用较为局限。

DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，可将基因组目标区域或感兴趣的目标核酸富集后，提高靶区域所占比例。因此，通过DNA靶向富集技术，富集特定疾病相关目标区域，如人外显子组，或者富集感兴趣的目标区域，如人线粒体DNA、感兴趣的基因区域、整合于人基因组上的乙肝病毒DNA，可大幅降低测序成本，潜力巨大。同时，高通量测序又能对测出的序列进行单碱基的观察，具有获得已知序列、部分已知序列甚至未知的序列，因此对临床诊断和科研具有重大意义。

同时，针对目标核酸靶向捕获后应用到高通量测序，在检测效果上，与以往的酶促反应/免疫检测等不同，可对核酸序列具体到单碱基的观察。同时，高通量测序中，对于检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用的观察，则需要达到一定的测序深度，而若未对具有变异的目标核酸进行富集，则测序结果中会存在大量的非有用信息的结果，造成测序的浪费，或者费用显著升高以至于很多研究和检测工作难以开展。而经目标核酸靶向捕获后再应用到高通量测序，可大幅降低检测样品中比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用等所需的成本，富集倍数即为测序成本降低的倍数。目前市场化的多区域长片段的富集产品主要是基于液相分子杂交与磁珠分离方法，如针对人外显子组的罗氏SeqCap EZ Exome Library SR试剂盒，安捷伦的SureSelect Human All Exon试剂盒和illumina的Rapid Capture Enrichment试剂盒等。该类方法由于其杂交富集过程的特殊性，首先需通过从已知数据库中获取所要富集的目标序列，经分析并生成所需的单链核酸序列，再通过芯片合成或其它人工制备方式，生成经过基团修饰的单链核酸探针，如带有Biotin修饰等；同时该类方法需要对磁珠或微球等固相载体进行修饰，使其带有可与单链核酸探针修饰的基团共价连接，如Streptomycin，修饰该制备探针和固相载体的过程成本较高。后在液相中核酸探针与目标核酸杂交，再通过核酸探针上的修饰基团与磁珠上的一个特异基团共价连接，形成目标序列：探针：固相载体复合物，富集目标核酸，后再经多次清洗并洗脱。其步骤较为繁琐，同时由于探针制备昂贵、探针标记以及修饰磁珠成本较高，造成目前所能富集的核酸序列的局限。

目前已有报导的其他多区域长片段的富集技术，绝大多数均需通过人工合成的方式，合成经修饰的单链核酸探针，同时制备经多次修饰的固相载体。其富集过程也多为先形成核酸探针：靶核酸复合体，再通过核酸复合体：载体富集，获得富集后的靶核酸序列。复合体与载体的结合，则通过核酸探针与固相载体的修饰基团，因此，不可避免的进行探针修饰与固相载体特定基团包被等，故而提高捕获成本，造成步骤的繁琐。

DNA靶向富集技术并应用到高通量测序，虽然可降低测序目标核酸的成本，但由于靶向富集技术的不同，如探针量、探针来源和探针制备等，会造成对目标核酸多样性造成影响，进而影响未知序列的富集、检测比例极低的变异、小范围或大范围核酸之间的相互作用。

由于目前所流行及通用的核酸富集技术，需通过人工方式合成单链核酸探针，因此，合成的探针越多越密集，所造成的成本越高，如若想达到针对大片段区域目标序列的单碱基覆盖度，其成本巨大，由此造成在探针合成成本和高丰度位点及高深度测序的选择上，处于两难之地。