[发明专利]环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性

说明书

本发明公开一种环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA甲基转移酶活性，基于链置换放大和指数型滚环扩增，设计了一种长茎环探针，其包括用于DNA甲基转移酶识别的甲基化位点、用于确保探针稳定的长茎部和用于引发后续放大的环部。长茎环探针中环部和小部分的茎部作为触发链用于后续的信号输出过程。该触发链被长茎部完全封闭在探针的环部，避免探针泄漏所引起的非特异性放大。长茎环探针被DNA甲基转移酶甲基化，且随后被限制性内切酶切割，产生触发链。在聚合酶和切割酶的协同作用下，所产生的触发链引发链置换放大，产生大量引物。所产生的引物引发指数滚环扩增，合成大量G‑四倍体序列，与染料相互作用而获得增强的荧光信号。

技术领域

本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及一种环介导的级联放大策略用于高灵敏检测DNA 甲基转移酶活性的方法。

背景技术

DNA甲基转移酶是一种表观遗传学修饰酶，在调节基因表达、发育和基因组印记方面 起重要作用。其通过在腺嘌呤或胞嘧啶上共价添加甲基而催化DNA甲基化。研究表明DNA甲基转移酶活性异常和疾病的产生和发展有关。显然，DNA甲基转移酶活性被认为是一种潜在的癌症生物标志物和癌症治疗中的药物作用靶点。因此，灵敏检测DNA甲基转移酶活性对于DNA甲基转移酶相关的癌症治疗和诊断至关重要。

用于DNA甲基转移酶活性检测的传统方法包括放射性标记法、凝胶电泳和高效液相色 谱。为了提高检测的灵敏度和特异性，许多新的方法包括电化学、化学发光、比色和荧光 方法已用于DNA甲基转移酶活性检测。在这些方法中，荧光方法作为有力的生物分析工具 用于DNA甲基转移酶活性受到广泛的关注。通常情况下，荧光方法通过使用双链探针或含 悬垂链的发夹探针用于目标物识别和信号转导。其中，信号转导链被部分地封闭在双链探 针或发夹探针茎部。经DNA甲基转移酶识别作用，双链探针或发夹探针释放信号转导链，且该信号转导链触发随后的信号输出过程。这种部分封闭方式会导致由探针泄漏所引起的非特异性扩增，产生假阳性信号。而在DNA甲基转移酶不存在时，双链探针或发夹探针与 报告探针间会发生竞争性杂交，致使非特异性背景扩增，影响检测的灵敏度和精确度。

发明内容

为了解决以上问题，基于链置换放大和指数滚环扩增，我们发展了一种环介导的级联 放大策略用于高灵敏荧光检测DNA甲基转移酶活性。我们设计了一种长茎环探针，其包括 用于DNA甲基转移酶识别的甲基化位点、用于确保探针稳定的长茎部和用于引发后续放大 的环部。长茎环探针中环部和小部分的茎部作为触发链用于后续的信号输出过程。该触发 链被长茎部完全封闭在探针的环部，避免探针泄漏所引起的非特异性放大。长茎环探针被 DNA甲基转移酶甲基化，且随后被甲基化敏感型限制性内切酶特异性地切割，产生触发链。 接下来，该触发链引发链置换放大和指数滚环扩增，合成大量富含G的序列。最后，其与 染料选择性相互作用，获得增强的荧光信号。

本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种用于检测DNA甲基转移酶活性的长茎环探针，该探针 包括长茎部和环部，所述长茎部包括紧靠环部的缓冲区域、DNA甲基转移酶特异性识别位 点序列和长茎部区域；其中所述缓冲区域的碱基对为1～7个。

常规茎环结构的设计是本领域技术人员熟知的技术内容，其包括茎部和环部，茎部通 常是由若干个互补的碱基对构成的杂交双链DNA序列，环部通常是由寡聚核酸形成的单链 序列。本领域的技术人员应当知晓构成茎环结构中的环部的常规序列，优选的，本发明中 环部序列的碱基数为10～25个。在本发明中的某些实施中，环部的序列可以为表1中斜体 序列所示：5′-A TAC GAC TCA CTA-3′，但并不仅仅限于以上序列，只要能够满足成环的 条件即可。