[发明专利]一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法

说明书

本发明涉及一种融合蛋白、使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。本发明的融合蛋白包括CRISPR蛋白、TALEN或者ZFN蛋白，生物素结合蛋白以及连接子；其通过将外源单链DNA分子招募到CRISPR、TALEN或者ZFN蛋白切割的双链DNA断裂处，实现外源DNA序列的高效、精确插入；与传统的CRISPR基因编辑技术相比，本发明的融合蛋白及使用其的同源重组方法大幅度地提高了同源重组效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种融合蛋白，使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。

背景技术

正常情况下，细胞内的单链供体DNA(ssDNA)，由于两端含有和基因组靶向序列互补配对的同源臂(homologous arm)，利用细胞内部同源重组机制，ssDNA以一定概率被细胞修复相关蛋白抓取到双链DNA断裂处，作为修复模板进行同源重组修复(homologousrecombination repair)；单链供体DNA内的外源序列，进而被整合到基因组中，实现精确的DNA序列敲入。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)是存在于微生物中的一种获得性免疫机制，用于抵御病毒、转座元件、接合质粒等移动遗传原件。CRISPR基因座编码Cas蛋白与CRISPR RNA(crRNA)，它们相互作用形成Cas9/crRNA/tracrRNA复合物，切割特定序列的线性或环形双链DNA。Cas9蛋白主要包含两个内切酶结构域：RuvC样结构域，其识别并切割与crRNA非互补的DNA链；和HNH核酸酶结构域，其切割与crRNA互补的靶DNA链。Cas9蛋白还包含PI结构域(PAM-interacting)，其作用于识别靶点序列附近的的PAM(protospacer adjacent motif)序列。

CRISPR/Cas9系统作为一种有力工具，已经广泛地用于基因编辑领域。目前常规的基因靶向敲入技术(knock in)流程如下：CRISPR/Cas9在gRNA的介导下，在目标DNA区域切割，形成双链DNA断裂(DSB，double strand break)。在细胞内基因修复机制下，相关蛋白复合体聚集在游离在双链DNA断裂附近，开始进行修复。一些物种的CRISPR-Cas9系统已成功应用于编辑真核/原核生物基因组，例如，酿脓链球菌Cas9(Streptococcus pyogenesserotype M1，简称Cas9sp)，嗜热链球菌Cas9(Streptococcus thermophilus，简称Cas9St)，来自脑膜炎双球菌血清组A/血清型4A的Cas9(Cas9from Neisseriameningitidis serogroup A/serotype 4A，strain Z2491)和金黄色酿脓葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus，Cas9sa)。其他携带II型CRISPR的物种，因其Cas9蛋白具有相似的结构，未来也有应用潜力。

CRISPR-Cas9基因编辑技术已经广泛地用于细胞水平、动物胚胎水平的实验，成功地构建基因敲入细胞系，基因敲入模式动物等，但是基因敲入的成功率比较低。此外，之前已经发展成熟的TALEN技术和ZFN技术，也均得到广泛应用。但是由于构建难度大，脱靶效率高等因素，在CRISPR技术出现后，TALEN、ZFN技术基本已经被替代使用。

发明内容

为解决现有技术中细胞内同源重组效率较低的问题，本发明提供了一种融合蛋白、使用其进行同源重组的方法以及其在将外源DNA分子同源重组到靶标序列中的应用。本发明的融合蛋白通过将外源DNA分子招募到CRISPR、TALEN或者ZFN所切割的双链DNA断裂处，使得外源DNA分子在此处大量富集，从而在实现外源DNA序列的精确插入的同时，大幅度地提高了同源重组效率。