[发明专利]产肠毒素大肠杆菌ETECF4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶N功能结合域

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和兽医学技术领域。具体涉及产肠毒素大肠杆菌ETEC F4菌毛直接受体蛋白猪氨肽酶N的验证及其功能结合域的确定。更具体地说，本发明提供能够识别ETEC F4三种血清型主要功能性亚基FaeG的宿主受体蛋白结合结构域的氨基酸序列。本发明中的蛋白结合结构域可以用作区别和研究不同血清型ETEC F4感染的依据，以及用作以APN为靶标筛选和研制F4受体模拟类似物和新型多肽疫苗的工具。

背景技术

新生和断奶仔猪腹泻是全球范围内影响养猪业发展最为普遍的胃肠道疾病，主要与产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4(或K88)在仔猪肠道内的黏附、定植和感染有关，该病原不仅能够引发仔猪黄痢、白痢、水肿病和断奶仔猪腹泻等多种疾病，还易混合、并发和继发多种疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三种血清型变异株，其中以F4ac最为常见。这三种血清型F4大肠杆菌在肠道细胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差异。研究发现，ETEC F4能否特异性结合猪小肠黏膜上皮细胞，取决于猪小肠黏膜上有无相应的受体，无F4受体的猪表现为抗性，不会感染F4大肠杆菌发病；而有受体的猪则表现为易感，在感染F4大肠杆菌后发病。

自1975年以来，有关F4菌毛受体的相关基因和蛋白陆续被报道：Gibbons等研究发现，F4ac受体由一对等位基因控制，符合孟德尔遗传定律，即呈显隐性遗传模式，其中显性基因S表现为有受体，隐性基因s表现为无受体。Edfors等将F4ac的受体基因准确定位于猪13号染色体q41区域，与Tf基因座仅相差7.4厘米并与F4ab受体基因紧密连锁(θ＝0.01，Z＝41.06)。等采用与Edfors定位F4ac受体基因所用的同一家系的猪进行实验，通过微卫星标记技术将受体基因定位在SSC13q41的SW207、S0075和Sw225之间，并进一步证实黏液素4(MUC4)基因内含子7的一个多态性突变位点(SNP)与大肠杆菌F4ac的易感性呈现表型共分离。2009年1月，Andersson、和Vogeli等带领各自团队联合开展精细定位，将F4ac受体基因所在区域由原来的26Mb缩短至14Mb，即SSC13q41的Sw207-S0075区域，并提出该受体基因最有可能位于Sw207-MUC4区域的设想。因此，MUC4基因很可能是大肠杆菌F4ac黏附易感性的一个极其重要的功能位置候选基因。但是，江西农业大学黄路生研究组发现MUC4基因标记在构建的白色杜洛克×二花脸资源家系始祖动物中没有多态性，而F2家系个体中有着充分分离的F4ac黏附表型，这表明该SNP标记只是与F4ac受体基因因果突变(causative mutation)呈一定连锁不平衡的分子标记，不能解释所有群体的F4ac受体遗传基础。Goetstouwers等和Rasschaert等的研究也发现，MUC4的分型与猪F4ETEC黏附分型结果并不完全一致，并进一步提出了存在其他受体基因或蛋白的假设。

中国农业大学张勤研究组以久仰香猪(抗性猪)、剑白香猪和长白猪为研究材料，采用差异显示技术，通过对比分析抗性个体和易感个体的表达谱带，筛选到了5条抗性相关特异性表达的EST。施启顺研究组则分析了沙子岭猪和约克夏猪对ETEC F4三种抗原型的黏附差异，并对13号染色体与ETEC F4受体基因相连锁的两个微卫星标记S0223和S0068在沙子岭猪和约克夏猪的遗传差异性进行了研究。黄路生研究组根据比较基因组学和生物信息学分析结果，在ETEC F4ac受体基因所在的SSC13q41区域选择了MUC4、MUC13、MUC20和TFRC 4个位置候选基因，并完成了对这些基因的染色体定位、多态位点鉴别及其与ETEC F4黏附表型的关联性研究。