[发明专利]从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途

说明书

本发明涉及一种从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途，该方法包括将包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的脱氧核醣核酸序列构成物(DNA construct)转入大鼠胚胎，将大鼠胚胎移殖到同品系母鼠中发育成成鼠，并从成鼠的结缔组织分离含有目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物，其中目标氨基酸序列为(i)与SEQ ID NO:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或(iii)与SEQ ID NO:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与SEQ ID NO:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

技术领域

本发明属于蛋白质领域，更具体地，涉及一种从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途。

背景技术

胶原蛋白是动物体内非常重要的蛋白质，是细胞外空间的重要的结构蛋白；胶原蛋白也是结缔组织的主成分，也存在于肌腱、韧带、皮肤、眼睛角膜等组织，约占动物体总蛋白质量的20％～30％。

胶原蛋白是由三股独立的胶原蛋白肽链、透过肽链上甘氨酸形成氢键，形成并维持三股螺旋互相缠绕的结构，称为原胶原。数个原胶原横向堆积后，相互间会发生羟醛缩合反应而产生共价连接，成为胶原微纤维；数个胶原微纤维再经过相似的反应而产生共价键合，形成胶原纤维，而胶原纤维便是胶原蛋白进行生理作用的基本型态。

胶原蛋白分为五种型，第一型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱、器官及骨骼中；第二型胶原蛋白主要存在于软骨中；第三型胶原蛋白为网纹纤维蛋白(reticulin)的主要成分；第四型胶原蛋白主要构成基底膜粘连蛋白(basal laminin)，存在于上皮组织的基底膜中(basement membrane)；第五型胶原蛋白存在于细胞表面、头发或胎盘中。

胶原蛋白具有极高的经济价值，可以广泛应用在医药或美容用途，例如可作为干细胞(stem cell)培养系统的支撑材料以帮助干细胞生长、含药型心血管支架上包覆药物的材料、烧烫伤病人伤口的敷料、胶原蛋白止血棉片、胶原蛋白膜骨填料、保湿抗老化妆品、口服营养补充品等等；目前市面上所见到的胶原蛋白商品，原料大多都是使用第一型胶原蛋白。

目前胶原蛋白的来源主要是从动物组织萃取得到，市场上常见的胶原蛋白可萃取自猪皮、牛皮、鱼皮、鱼鳞等等，例如中国台湾专利申请TW I487711便是以鲔鱼鱼皮为原料进行胶原蛋白的萃取。但源自动物的胶原蛋白可能会引起过敏反应，例如对海鲜过敏的人可能就不适合使用萃取自鱼皮/鱼鳞的胶原蛋白产品。为了降低胶原蛋白导致的过敏现象，美国专利申请US20120284817A1便利用基因工程的方法，以转基因植物合成人类胶原蛋白，但由于植物与哺乳类动物的酶系统并不完全相同，产生的胶原蛋白翻译后修饰(posttranslational modification)的状态仍与一般源自哺乳类的胶原蛋白不同。

另外，中国专利申请CN101812457A公开了采用大肠杆菌来表达人类胶原蛋白片段。然而，细菌表达产生的致热原致使表达产物难以应用于临床，目的蛋白通常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。为了克服细菌表达体系具有内毒素、致热原的安全问题，越来越多的研究者开始利用真核微生物来表达重组类人胶原蛋白，例如，中国专利CN102020716A公开了采用酵母细胞来表达重组类人胶原蛋白。然而，利用真核细胞表达的人胶原蛋白仍然存在纯化困难、纯度不高以及蛋白降解的问题。此外，这些利用真核细胞表达的胶原蛋白的氨基酸序列与人体不完全相同，在生物安全性和生物相容性方面也存在缺陷。

发明内容

鉴于上述现有的以转基因生物制备胶原蛋白在实际实施使用时仍具有多种缺陷，发明人对其加以改善，并据此研究得到本发明。