[发明专利]一种达托霉素的纯化方法

说明书

本发明提供了一种达托霉素的纯化方法。具体而言，该方法首先使发酵液经过澄清，再经过大孔吸附树脂和阴离子交换树脂分离，然后采用纳滤浓缩，除内毒素和脱盐、浓缩、过滤等获得高纯度的达托霉素；其中，所述的大孔吸附树脂和阴离子交换树脂分离的步骤顺序可调换。本发明提供的提纯方法所获得的产物纯度高、杂质少，且操作简单。

技术领域

本发明涉及一种抗生素的提纯方法，具体的说是一种达托霉素的提纯方法。

背景技术

达托霉素为一类新型的环脂肽类抗生素，由玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵而得，是目前全球首个成功开发的环脂肽类抗生素。达托霉素结构新颖，杀菌机制独特，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并杀死革兰氏阳性菌，特性表现为抑制作用迅速、体内与体外杀菌作用所需的浓度低，抗生素作用的有效性时间长。在临床上用于治疗因需氧革兰阳性菌引起的感染。达托霉素对耐抗生素的革兰阳性菌，包括对甲氧西林、万古霉素和利奈唑胺耐药菌仍有效。

2003年FDA批准了达托霉素注射剂用于治疗由革兰氏阳性菌所致的复杂皮肤和软组织感染，以及金葡菌引起的菌血症和右侧心内膜炎，其安全性和耐受性好，是一种应用前途广阔的抗生素。

美国专利US6696412公开了一种“阴离子树脂-疏水性树脂-阴离子树脂”三步纯化达托霉素的方法；美国专利US8058238和US8604164公开了一种“形成聚集体并从聚集体中获得较纯的达托霉素”的纯化方法；美国专利US8853357公开了一种“澄清料液-阴离子树脂-pH2.5-5.0条件过滤”的纯化方法；美国专利US8697638、US8846610和US8796224公开了“用低脂肪醇和乙酸钙形成钙盐沉淀或结晶的条件和钙盐晶型”提纯达脱霉素的方法。但上述方法存在操作繁琐、控制条件苛刻、使用填料和设备价格昂贵等缺点。需要找到新的提纯方法，以简化操作、降低成本。

发明内容

本发明目的是提供一种稳定、易操作、低成本的纯化达托霉素的方法。

本发明提供的纯化方法包括如下步骤：

1)将达托霉素发酵液澄清；

2)将澄清的发酵液经过大孔吸附树脂层析分离得到洗脱液；

3)将上述洗脱液经阴离子交换树脂层析；

4)将步骤3)收集的洗脱液经过纳滤膜浓缩得到浓缩液；

5)任选地，将上述浓缩液经过超滤膜超滤；

6)将上述步骤4)所得浓缩液或步骤5)超滤后获得的透出液沉淀，并收集沉淀；

7)将收集到的沉淀溶解后经纳滤脱盐或阳离子树脂脱盐；

其中，所述的步骤2)、3)顺序可调换。

所述的达托霉素发酵液指的是依照本领域已知的方法发酵制备达托霉素时得到的发酵液，例如，依照CN1013120B所公开的方法来发酵而得到的发酵液。这些发酵液中除了含有达托霉素外，还含有大量的杂质。

根据本发明提供的纯化方法，可得到纯度大于95％的达托霉素。为方便保存，在经过上述步骤7后得到的流出液经过浓缩、0.22μm膜除菌过滤、灌装、-20℃以下冷冻保存得到达托霉素冷冻块或进行冷冻干燥获得冻干粉末。

在本发明优选的实施方案中，所述的澄清步骤使用的是陶瓷膜、板框或连续流离心机进行澄清；所述陶瓷膜优选孔径为0.1-0.2μm。所述的纳滤膜可以是截留分子量为300-900Da的纳滤膜。所述的超滤膜可以是截留分子量为8-30KDa的超滤膜。步骤6)中所述的沉淀可以通过加入异丙醇来完成。