[发明专利]人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR-T载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种人源白细胞介素6的siRNA、重组表达CAR‑T载体及其构建方法和应用。本发明所述的IL‑6敲减siRNA表达框及其siRNA表达产物，不仅可以应用于CAR19‑T治疗急性B淋巴细胞白血病(ALL)中用于消除或减轻CRS的症状，还可应用于缓解CAR‑T治疗诸如B淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、骨髓瘤等等所有类型肿瘤时引起的CRS症状，甚至还可以应用于缓解其他类型的治疗引起的CRS。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种人源白细胞介素6(IL-6)的siRNA、重组表达CAR-T载体(尤其是一种通过敲减IL-6的用于缓解CRS的CAR-T转基因载体)及其构建方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗的理论基础是免疫系统具有识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞(高度特异性的细胞溶解)的能力。1950年代，Burnet和Thomas提出了“免疫监视”理论，认为机体中经常会出现的突变的肿瘤细胞可被免疫系统所识别而清除，为肿瘤免疫治疗奠定了理论基础[Burnet FM.Immunological aspects of malignant disease.Lancet,1967；1:1171-4]。随后，各种肿瘤免疫疗法包括细胞因子疗法、单克隆抗体疗法、过继免疫疗法、疫苗疗法等相继应用于临床。

2013年一种更先进的肿瘤免疫疗法---CAR-T疗法成功用于临床，并表现了前所未有的临床疗效。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。CAR-T疗法在临床上最领先的有诺华的CLT019，采用CLT019治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者，六个月的肿瘤无进展生存率达到67％，其中最长的应答时间达到两年多。总部位于中国上海的上海优卡迪生物医药科技有限公司与医院合作，共治疗复发难治急性淋巴细胞白血病患者36例，其中完全24例，缓解比例达到66.6％。这是抗癌研究的颠覆性突破。CAR-T细胞疗法可能是最有可能治愈癌症的手段之一，并被《Science》杂志评为2013年度十大科技突破之首。

CAR-T疗法虽然效果显著，但是在治疗过程中会出现一类特殊的临床综合症，临床常表现为发热，低血压，寒颤，以及出现与血清中一系列细胞因子水平显着升高有关的神经系统症状，被称为细胞因子释放综合症(Cytokine Release Syndrome，CRS)。其发生机制是由于抗原与T细胞受体结合后，激活了T细胞，T细胞被激活后释放了包括IL-6在内的一系列细胞因子，造成了一种系统性的炎症反应，IL-6信号通路如图1所示。如果治疗不及时，很可能引起肺水肿而导致患者死亡。

目前临床上可通过静脉注射抗组胺类药物(如扑尔敏)或皮质类固醇(如氢化可的松)来抑制炎症反应，但是相应的，CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用也被抑制，使得这类患者，有较高的复发率，影响CAR-T治疗的疗效。

还有一个比较可行的方案是使用商品化的托珠单抗来控制CRS的发生程度。托珠单抗是一种人源化的IL-6受体单克隆抗体(Tocilizumab)，托珠单抗与IL-6受体发生特异性结合，阻断IL-6信号转导，从而减少急性时相反应物、降低铁调素产物、减少B细胞活化、减少骨吸收和软骨转化，以及抑制T淋巴细胞向Th17细胞的分化，从而有效控制炎症反应。但是托珠单抗也有一些很明显的缺点，首先是费用很高。一支10kg体重剂量的托珠单抗价格约为2000元RMB，成年患者一般一次要用5支，普通家庭难以承受。其次是使用托珠单抗后，由于封闭了IL-6受体，导致患者后期很容易遭受感染。

自从20世纪90年代以来，研究人员发现双链RNA(“dsRNA”)可以用来抑制蛋白表达。这种沉默基因的能力在治疗人类疾病方面具有具有广泛的潜力，和许多研究人员和商业实体目前投入相当大的资源在发展中基于这种技术的治疗方法。