[发明专利]一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法

权利要求书

1. 一种基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，其特征在于采用微流控芯片，按照如下步骤进行：

(1) 芯片胶原灌注

冰上操作，Matrigel胶原为工作液，用移液器将Matrigel胶原工作液加入胶原入口池，每孔3μl ；加1ml PBS 缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育5min或室温放置10分钟凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入细胞培养液；

(2) 芯片细胞球接种及培养

将提取的原代大鼠肾小球微组织细胞球制成悬液，取10μl悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走10μl细胞培养液，将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置；竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置10min 后，取出观察，细胞球紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处将芯片放平移入37℃培养箱中培养、培养48h, 每隔24h 换液一次，并拍照记录肾小球细胞贴附Matrigel胶原界面所在位置；

(3) 芯片构建的肾小球滤过功能评价方法

经48小时静止培养，肾小球细胞重新排列于胶原的半弧形界面，形成肾小球滤过屏障，分别用红色，绿色荧光标记的IgG通入细胞培养室和相连培养基通道，对肾小球蛋白的渗透性进行表征，

(4) 高糖条件培养肾小球细胞

待肾小球细胞芯片上静止培养48h后，向细胞培养室添加三个葡萄糖浓度条件培养基：正常培养基组，5mM 葡萄糖组，30mM葡萄糖组，培养基流速均为150μl/h，37℃培养箱中培养，每隔24h并拍照记录肾小球细胞贴附Matrigel胶原界面所在位置及细胞迁移室位置；

(5) 芯片细胞迁移实时监测

采用活细胞工作站CO₂显微载物台培养箱进行细胞长期观察，每隔60min 拍照一张，实时记录细胞运动位置及形态改变；

所述微流控芯片由上下两层PDMS粘合封接而成，包括细胞入口池（1），胶原入口池（2），培养基入口池（3），废液池（4），细胞培养室（5），培养基灌流室（6），细胞球捕获槽（7），细胞迁移室（8）；

细胞迁移室（8）两端为胶原入口池（2），中间部分为“丰”字形，中间的横向结构为对称排列着7~10个细胞球捕获槽（7），细胞迁移室（8）通过一边的细胞球捕获槽（7）与培养基灌流室（6）连接，细胞迁移室（8）通过另一边的细胞球捕获槽（7）与细胞培养室（5）连接；

细胞培养室（5）上连细胞入口池（1），下连废液池（4）；

培养基灌流室（6）为C型，一端为培养基入口池（3），另一端为废液池（4）；

所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，细胞培养室（4）高度为200-1000μm，胶原入口池（2）和细胞迁移室（5）高度为100 -300μm；细胞球捕获槽（7）为半球形，可使胶原形成凹面。

2.按照权利要求1所述的基于微流控芯片体外糖尿病肾小球模型的构建方法，其特征在于：芯片上肾小球模型所用细胞来源于原代肾小球微组织，含有肾小球内皮细胞和足细胞。