[发明专利]一种基于微流控芯片的肾小球体系及其应用

权利要求书

1.一种基于微流控技术的肾小球芯片，其特征在于：在具凹型通道界面的微流控芯片上建有肾小球屏障，该微流控芯片由左侧主通道(1)、右侧主通道(4)、胶原通道(3)、胶原通道入口(5)、左侧主通道入口(6)以及右侧主通道入口(7)组成，胶原通道(3)左连左侧主通道(1)，右连右侧主通道(4)；

左侧主通道(1)为I形或U形，所述芯片的右侧主通道(4)为U型，所述胶原通道(3)为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧主通道(1)和右侧主通道(4)相连接，横向结构的数量为1～10个；胶原通道(3)与左侧主通道(1)的交界为半球形界面，胶原侧为凹面；

所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道(1)、右侧主通道(4)高度为200～500μm，胶原通道(3)高度为80～200μm，主通道高度：胶原通道(3)高度为3:1。

2.按照权利要求1所述的基于微流控技术的肾小球芯片，其特征在于：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为具微结构的可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃或不具结构的可透光透气的PDMS聚合物。

3.一种采用权利要求1所述肾小球芯片的肾小球体系，其特征在于：采用基于微流控技术的肾小球芯片，该肾小球体系按以下步骤构建：

(1)芯片预处理

设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，室温30min固化，将培养基引入主通道；

(2)肾小球的接种与培养

提取原代大鼠肾小球微组织，调整至10⁴～10⁵cells/mL的细胞悬液，加入左侧主通道，侧立培养过夜，在光学显微镜下观察可见肾小球微组织贴附于胶原界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次。

4.一种基于权利要求3所述肾小球体系的应用，其特点在于，该体系用于以下方面：

(1)使用CCK-8试剂盒进行细胞活性的检测，按CCK-8试剂：细胞培养基的体积比为1:9混合均匀成检测工作液，加入左侧主通道(1)，置培养箱中3小时后，转入96孔板中，酶标仪测定450nm处吸光度，可以对细胞活力进行定量，作为药物毒性的指标之一；

(2)LDH漏出，收集芯片通道内细胞培养液，使用LDH试剂盒，操作检测LDH浓度，观察药物对细胞的损伤程度，作为药物毒性的指标之一；

(3)免疫荧光，常规免疫染色操作，荧光显微镜观察拍照，可以进行Live/Dead染色，观察细胞活力；ZO-1染色，观察细胞紧密连接情况；F-actin染色，观察细胞骨架等作为药物毒性的指标；

(4)蛋白滤过，使用白蛋白标准液，加入左侧主通道，1小时后，收集右侧主通道培养液，白蛋白试剂盒操作检测蛋白浓度，观察中分子量白蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标；

(5)蛋白滤过，使用Igg，加入左侧主通道，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60min拍照，分析Igg渗透性，观察高分子量蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标。