[发明专利]用灵发素诱导烟草胚状体的方法

说明书

本发明公开了一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，以灵发素作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。本发明以灵发素作诱导剂制备的诱导培养基比传统的培养基诱导烟草胚状体形成速度快、产量高、质量好，且原始外植体无需转瓶进行继代培养，即可直接达到生产烟草胚状体的目的。

技术领域

本发明涉及植物生物工程组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法。

背景技术

“胚状体”也叫做“体细胞胚”或“体胚”，以区别于“合子胚”，是由愈伤组织中的部分薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接再分化形成具有胚的功能的结构。“胚状体”在生产实践上可以直接用于制造人工种子和生产再生植株(试管苗)；在理论研究上，是探索细胞分化、器官建成、个体发育及其相关的解剖学和生理生化变化过程的重要材料。因此，如何获得胚状体是植物学界关心的热门技术领域之一。

但是，国内有关烟草组培技术的资料不多，特别是烟草胚状体诱导技术的研究报告更少。具有代表性的有：王瑞库等人研究发表的影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-铁盐、蔗糖和腺素及影响烟草花粉胚胎发生的某些因子-氨基酸和激素。司龙亭等人研究发表的烟草人工种子研究进展初报。贾勇炯等人研究发表的在烟草花药培养中诱导胚状体发生的研究。潘莉等人研究发表了烟草未授粉子房单倍体诱导及影响因素的研究。王连华等人研究发表了烤烟K326人工种子悬浮培养条件下体细胞胚胎的发生研究。慕平利等人研究发表了烟草叶片直接再生-基因转化体系的建立。周田等人研究发表了钾高效烤烟杂交品种花药培养研究。现有诱导烟草胚状体的资料，已经分别涉及到MS,H,Nitsch,等不同的基本培养基、不同基因型的栽培品种、不同器官作外植体和固体或液体悬浮等不同的培养方法。但是，就其重要的研究结果而言，可归纳为以下两点：1、适量的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)对烟草胚状体的发生必不可少。增加铁盐、腺素(即腺嘌呤)、KT(激动素)、IAA(吲哚乙酸)和谷氨酰胺等，有利烟草胚状体的发生和发育。由此可见，烟草胚状体的诱导培养基都是由多种诱导剂成分复合配制而成，程序发杂，尚未见用单一诱导剂成功诱导烟草胚状体的报导。2、现有传统技术对烟草胚状体的诱导周期长，效率低。而且原始外植体都要反复转接到新培养基(以减轻2,4-D的毒副作用)进行继代培养，甚至多达5-6代的培养，长达3-4个月才能发生胚状体。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，以同时具有细胞分裂素和生长素生物活性的灵发素作诱导剂制备的诱导培养基，比传统的培养基诱导烟草胚状体形成速度快、产量高、质量好，且原始外植体无需转瓶进行继代培养，即可直接实现烟草胚状体的生产。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用灵发素诱导烟草胚状体的方法，以灵发素作诱导剂制备诱导培养基进行烟草叶片外植体的胚状体诱导。

优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基为配方为：MS+灵发素3.0-5.0mg/L，pH为5.8～6.0。

优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，当其长至5、6片叶时，自上至下取第3片叶，在无菌条件下切成方片，即得烟草叶片外植体，备用。

优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，将自上至下的第3片叶在无菌条件下切除叶柄以上2mm和叶尖以下2mm的叶片部分，留叶片中间部分，再沿其主脉两侧分切成5mm×5mm的方片作烟草叶片外植体。

优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，将所述烟草叶片外植体接种于灭菌后的诱导培养基中培养25天，获得烟草胚状体。

优选的是，所述的用灵发素诱导烟草胚状体的方法，所述诱导培养基中灵发素的浓度为4.5mg/L。

本发明至少包括以下有益效果：