[发明专利]一种高亲和力胰岛素核酸适体INS4及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白检测技术领域，涉及一种核酸，特别是涉及高特异性和高亲和力的胰岛素核酸适体及其制备方法。

背景技术

胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗。

胰岛素的生物合成速度受血浆葡萄糖浓度的影响，当血糖浓度升高时，β细胞中胰岛素原含量增加，胰岛素合成加速。胰岛素在胰岛β细胞中合成。胰岛素的分子量5700，由两条氨基酸肽链组成。A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。A-B 链之间有两处二硫键相连。胰岛素是与C肽以相等分子分泌进入血液的。临床上使用胰岛素治疗的病人，血清中存在胰岛素抗体，影响放射免疫方法测定血胰岛素水平，在这种情况下可通过测定血浆C肽水平，来了解内源性胰岛素分泌状态。

目前胰岛素的检测方法有三大类：色谱法、免疫学法、循环酶法。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、色谱柱制备诸多变异，使其难以标准化；而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专门的维护人员，使其推广困难。免疫学法需要还原游离INS形式，抗体荧光分析法和比浊法不能直接检测游离型同型半胱胺酸，只能检测血浆总同型半胱胺酸，用还原剂在37℃半小时卵育对血样进行还原处理。免疫学法需一小时以上才能出结果，操作步骤繁琐，因为需要进行还原处理可受一些不确定的因素影响。循环酶法过程繁琐，且检测限低、产生误差较大，价格昂贵，故得不到推广。

核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分子，近年来受到科学家的广泛关注，大量针对重要生理活性分子的核酸适配体被筛选出来；各种基于核酸适配体的分析方法和技术已被报道；核酸适配体药物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批准上市。SELEX技术筛选得到的寡核苷酸序列被称为适配子, 国内其翻译为核酸适体、核酸适配子、核酸识体或核酸适配体等。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~ 60 个核苷酸。

由上可知，核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测类胰岛素的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。但是目前基于核酸适体的针对于胰岛素的高效特异性识别研究还很缺乏，且针对于胰岛素的核酸适体及其筛选制备方法尚未见有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的胰岛素检测技术的不足，填补还未见胰岛素的核酸适体及其筛选制备方法空白，提供一种胰岛素核酸适体及其制备方法，本发明所提供的核酸适体命名INS4。

本发明的方案是通过这样实现的：一种胰岛素核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的核苷酸序列其序列为：gtagggatgc tcgaacggta agtctctgat ctccgtgaat aactcgtccc ccatctgg。

以上所述胰岛素核酸适体的衍生物，所述衍生物包括以下四种中的任意一种：

（1）将权利要求1中所述核酸适体任意位置上的碱基A、T、C或G置换成稀有碱基甲基化嘌呤、二氢尿嘧啶或次黄嘌呤后，得到的核酸适体衍生物；

（2）权利要求1中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架；

（3）权利要求1中所述核酸适体改造成的肽核酸；

（4）权利要求1中所述核酸适体改造成的锁核酸。

一种以上所述胰岛素核酸适体或其衍生物在识别、检测胰岛素，或者制备检测胰岛素的试剂盒方面的应用。

为了使本发明公开充分，本发明胰岛素核酸适体的制备方法步骤如下：

胰岛素核酸适体的制备方法包括以下步骤：

1） 合成单链DNA随机序列寡核苷酸库：所述单链DNA随机寡核苷酸库的两端为固定序列，作为PCR扩增引物结合区，中间为60个碱基的随机序列，库容量10¹⁵以上。所述PCR引物为：

引物1：5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’

引物2：5’-Biotin-AGATTGCACTTACTATCT-3’