[发明专利]夏至草原生质体制备方法

权利要求书

1.一种夏至草原生质体制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

步骤1，夏至草的预处理：选取幼叶的夏至草，用组织清洗液浸泡清洗所述夏至草3～4次，每次浸泡30～40s，清洗后用滤纸吸除夏至草叶片表面的水分；其中，所述组织清洗液由去离子水和下述浓度的化合物组成：

NaCl 8～9g/l

Na₂HPO₄·7H₂O 32～34g/l

NaH₂PO₄ 10～12g/l

步骤2，将所述夏至草剪至3～6mm²，放入离心管，用幼叶固定液固定所述夏至草至少20min；用微量移液枪吸除所述幼叶固定液，并用步骤1中所述组织清洗液清洗该夏至草2～3次；其中，所述幼叶固定液由下述体积浓度的物质组成：

无水乙醇 74～75％

冰醋酸 24～25％

盐酸：0.9～1.1％，其中，所述盐酸的浓度为0.9～1.1mol/L；

步骤3，在黑暗或光强小于10μmol·m^-2s^-1的条件下，用23～28℃的混合酶解液酶解步骤2中所得夏至草至少0.5小时，得到夏至草原生质体；其中所述混合酶解液由下述浓度的物质组成：

2.根据权利要求1所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，用幼叶固定液固定所述夏至草20～45min。

3.根据权利要求1所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，在酶解过程中，每间隔10分钟晃动浸泡有所述夏至草的混合酶解液。

4.根据权利要求1所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，在所述步骤3之后，用20～25℃的原生质体洗涤液离心清洗所述夏至草原生质体3～4次，所述原生质体洗涤液由去离子水和下述浓度的化合物组成：

5.根据权利要求4所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，离心清洗所述夏至草原生质体时，将20～25℃的原生质体洗涤液轻柔地打入离心后所得沉淀的底部，混悬所述沉淀。

6.根据权利要求5所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，每次离心清洗3～5分钟。

7.根据权利要求6所述的夏至草原生质体制备方法，其特征在于，相对离心力为2000～2500×g。