[发明专利]一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明的突变体为Y198F，Y291V，Y319F，A322G和A322S；其中A322S在70℃表现出最高酶活力，比P1C2T2增加将近40％。所有突变体的半衰期均大于野生型角蛋白酶KerSMD，其中A322S热稳定性最强，半衰期达到185min。本发明获得四种胞外酶催化活力明显提升的定点突变体198Y198F，Y319F，A322G和A322S，其中Y319F催化活力为最大值1558U/ml，是出发突变体P1C2T2菌株的3倍。比酶活提升明显的角蛋白酶主要有198Y198F、Y319F。因此，本发明的角蛋白酶突变体A322G的热稳定性和胞外角蛋白酶催化活力都获得明显提升，比野生型角蛋白酶更具有应用的价值和潜力。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性和催化活力提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶(keratinase)，是一种由微生物产生，可以降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等)的特异性蛋白酶。角蛋白酶作为一种底物专一性宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，在工业化应用中具有很大的潜力，可以替代传统蛋白酶，用于羽毛降解、皮革纺织、饲料添加剂、有机化肥和洗涤剂等方面。此外，角蛋白酶还可效降解引起绵羊瘙痒症和疯牛病的阮病毒。随着工业化的发展，野生菌所产角蛋白酶性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶生产强度。重组角蛋白酶一般经过性能改造，胞外酶活单一，简化了发酵下游的纯化工作。另外，工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响角蛋白酶活性。为减省生产成本，必须实现角蛋白酶重复利用，另外还需要催化活力高，底物专一性强的角蛋白酶进行精细化学的催化。人们从自然界筛选分离地角蛋白酶已经远远不能满足工业化需求，所以通过分子改造技术寻求新型角蛋白酶将是一个新的研究手段。

发明人前期对来源于嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophiliaBBE11-1)的角蛋白酶KerSMD进行了异源表达和结构域互换改造，获得了热稳定性提高的角蛋白酶突变体P1C2T2(一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法；申请号：CN201410276309.3)。但在大肠杆菌的胞外表达中，胞外催化活力低。为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高角蛋白酶的热稳定性和催化效率。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种角蛋白酶突变体，突变体与野生型角蛋白酶相比有更好的热稳定性和/或催化活力。

本发明的第一个目的是提供一种角蛋白酶突变体，所述突变体的氨基酸序列是在SEQ IDNO.1的角蛋白酶P1C2T2的氨基酸序列的基础上，将第198位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(命名为Y198F)、将第291位的酪氨酸突变成缬氨酸(命名为Y291V)、将第319位的酪氨酸突变成苯丙氨酸(命名为Y319F)、将第322位的丙氨酸突变成甘氨酸(命名为A322G)或者将第322位的丙氨酸突变成丝氨酸(命名为A322S)。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶P1C2T2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述角蛋白酶突变体的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述突变体的氨基酸序列的重组质粒载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒载体是在pET系列、pGEX系列、pPICZ系列、pAN系列或pUB中的任意一种质粒的基础上构建得到的。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌，是细菌、酵母或者其他真菌。