[发明专利]一种快速提取棉花单粒种子的方法

说明书

本发明提供了一种快速提取棉花单粒种子的方法，属于分子生物技术领域。本发明选用萌动的单粒棉种种仁作为提取材料，直接在裂解液中打碎、裂解，经过多次离心、沉淀，提取得到棉花种子。该方法操作简便，可快速进行大批量提取，耗时少、提取过程中减少化学试剂的使用，减少了污染，适用于利用SSR标记快速鉴定棉花品种纯度过程中样品的获得。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种快速提取棉花单粒种子的方法。

背景技术

近年来，分子标记技术越来越广泛地应用于作物种子纯度及品种真实性检测研究中，而影响分子标记鉴定效率的瓶颈是的提取。棉花分子纯度检测中，一般是从棉株叶片中提取样品，由于棉花幼苗培养周期较长，所以利用叶片提取的方法不能满足于商业化生产中棉花种子纯度快速鉴定的要求。而直接利用种子提取无疑将会缩短种子纯度检测的时间，但作物种子中富含蛋白、淀粉等物质，因而增加了提取的困难。棉花种子除富含蛋白外，还含有棉酚、多糖、单宁等次生代谢物，这些代谢物在细胞破裂时容易氧化，且氧化后与蛋白质、核酸等发生不可逆反应，形成棕色胶状复合物，因此棉花种子提取的步骤较其他作物更为复杂。随着植物提取技术的不断发展，种子提取技术也在逐步完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、安全、快速的提取棉花种子的方法，以解决传统方法中棉花种子提取过程繁琐、耗时较长的问题，满足种子纯度快速鉴定的需要。

本发明提供一种提取棉花单粒种子的方法，包括以下步骤：

1）将棉花种子于水中浸泡至种仁松软后，剥掉种皮，得到萌动松软的种仁；

2）将步骤1）得到的种仁加入裂解缓冲液中，粉碎；

3）水浴、离心、取上清液，加入异丙醇，混匀；

4）离心，用乙醇洗涤沉淀，干燥；

5）加双蒸水溶解，再次离心，取上清液，得到。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂均为市售。

以棉花品种鲁棉研37号和鲁6269为实验材料，通过具体实例对本发明做进一步的描述。具体实例统一采用10μl PCR扩增体系，具体组分及程序如下。取1.2μl PCR扩增后产物，用浓度为8%的非变性PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳检测。

实施例1

本发明方法提取的样品的稀释倍数对PCR扩增的影响

（1）提取

将鲁棉研37号的干种子泡在水中，室温条件下浸泡20小时种仁松软后，选取12粒种子，剥掉种皮，将萌动的种仁放入12个2ml离心管中，每管再加入700μl裂解缓冲液（组成成分：2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，2%PVP,1%β-巯基乙醇），粉碎。60℃水浴25min，间隔10min左右轻摇一次。10000r/min离心9min，取500μl上清液，加入0.8倍体积预冷的异丙醇，混合均匀，12000r/min离心2min，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀，空气中干燥30min后，加入200μl双蒸水，用枪头搅匀使溶解，溶解30min后。12000r/min离心1min，取150μl上清液，上清液即为提取样品。

（2）扩增